PCR
A técnica da PCR permite que um fragmento específico da molécula de DNA seja amplificado milhares de vezes em apenas algumas
horas. Esta técnica revolucionou as pesquisas em biologia molecular, pois até então demorava-se muito tempo para a amplificação do
DNA. A partir da PCR é possível obter-se cópias de uma parte do material genético em quantidade suficiente que permita detectar e
analisar a sequência que é alvo do estudo. A reação pode ser comporada a uma procura por uma única pessoa em uma grande cidade e
cloná-la ao ponto de poder povoar toda a cidade.

A reação explora função natural da enzima chamada de taq- polimerases, extraída da bactéria Thermus aquaticus, que é uma enzima
termoestável, fato de imensa importância uma vez que a reação se processa em ciclos de diferentes temperaturas, como será dito mais
adiante.

Este processo de amplificação do DNA foi inventado por Kary Mullis em 1983 e a primeira amplificação feita foi a da betaglobulina
humana. Desde então, houve um aumento exponencial no número de publicações científicas que relatavam utilizar a técnica da PCR em
experimentos, passando de 3 publicações em 1986 para 1700 em 1990. Esta descoberta condecorou Kary Mullis com o prêmio Nobel de
Química dez anos após sua invenção. O fato central que faz a PCR tão útil é que todo organismo vivo possui sequências de nucleotídeos
no DNA que são únicas e específicas para cada espécie.

Esta reação permite a amplificação de qualquer seqüência de DNA coletada de amostras de materiais biológicos como sangue, urina,
outros fluidos corporais, cabelo e fragmentos teciduais. Amostras de microorganismos, células vegetais ou animais mesmo que com
milhares de anos, também podem ser detectadas pela PCR.

Para a execução da técnica da PCR é preciso que se tenha conhecimento prévio da seqüência do ácido nucléico que se deseja amplificar,
dita "seqüência alvo." A partir disto, desenham-se dois iniciadores ("primers") para dar partida ao processo de síntese em um local
específico.Um "primer" serve para sintetizar a seqüência alvo no sentido 3’- 5’e outro para o sentido inverso isto é, 5’-3.’ O "primer" é
uma pequena seqüência de nucleotídeos que hibridiza no início da seqüência alvo que se quer amplificar e da qual ele é complementar.
Ao reconhecer o "primer," a polimerase sintetiza uma cópia complementar, obedecendo à informação contida na seqüência de DNA que
será replicada (sintetizada).

Etapas do processo:

Extração do DNA da amostra que se pretende estudar
Purificação do DNA
Preparação de uma mistura chamada Master Mix, que conterá todas as substâncias necessárias à sintese de novas cópias de DNA
Incubação em um termociclador, que é o aparelho responsável pela execução de todos os ciclos da reação aquecendo e resfriando
o/os tubo/s
Eletroforese em gel de poliacrilamida dos produtos da PCR
Revelação e fixação do gel

Reagentes da PCR:

Solução tampão para se garantir pH e concentrações iônicas adequadas à reação
Deoxinucleosídeos trifosfatos ( dATP, dGTP, dCTP, dTTP ) que atuam como tijolos na construção das moléculas de DNA
Os primers
A Taq-polimerase
H2O
Mg+2 para optimizar a reação (nem sempre é usado)
O DNA extraído da amostra
Alguns adjuvantes quando necessário

A reação em si – os ciclos:

Existem três fases básicas ou ciclos para cada reação de PCR. Cada ciclo contém um ou mais passos e duas variáveis em
cada passo: a temperatura e a duração.

Etapa de desnaturação inicial: consiste de um único passo de desnaturação a 94ºC por 5 minutos. Dificilmente altera-se esta
etapa.

O bojo da PCR toma local neste ciclo, que é subdividido em três:

1)Etapa de anelamento; este é o passo que habilita os primers a anelar a fita simples desnaturada. O tempo necessário
para anelamento é de 30-45 segundos.

2) Etapa de extensão. É neste passo que a Taq polimerase age para estender o molde. Regularmente ela é realizada a temperatura de
72º (a atividade enzimática ótima é de 76 - 79ºC), dificilmente altera-se a temperatura de 72º. Uma regra para se estimar a
extensão do tempo é a de que para cada 1000 nucleotídeos atribuímos 1 minuto. Outra fórmula popular é calcular 60 bases
por segundo.

3) Etapa de desnaturação: A desnaturação da molécula de DNA formado serve como molde para o próximo ciclo. Ela é
realizada a temperatura de 93-94ºC. Nesta temperatura a enzima tem uma meia vida de cerca de 1 hora.

Estes três passos são repetidos 30-40 vezes em particular para análises de digestão. Se os ciclos excederem esta
quantidade eles poderão introduzir mutações com a Taq polimerase.

Etapa de extensão final. Isto é feito com um único ciclo em dois passos: um passo de anelamento o qual é idêntico ao
passo de anelamento na segunda etapa de PCR (mesmo tempo e mesma temperatura). O segundo é a de extensão
longa temperatura idêntica ao passo de extensão, porém com duração de 3-5 minutos ( 72ºC) por 5 minutos. Isto
habilita toda amplificação semi-iniciada a se completar.

 

Diferentes aplicações da PCR:

Estudo do padrão de expressão gênica (transcritos raros)

Seleção de clones recombinantes

Sequenciamento direto de produtos amplificados

Detecção de mutações em genes específicos

Estudos diagnósticos de doenças infecciosas, detecção de bactérias, vírus e protozoários parasitas

Diagnóstico pré-natal em caso de risco

Elucidação de relações evolutivas entre espécies, utilizando material arqueológico

Grande valia na Medicina Forense (impressão digital de DNA)

Revelação da PCR em gel de poliacrilamida;