Técnicas Histológicas

 

 

A técnica histológica visa a preparação dos tecidos destinados ao estudado à microscopia de luz. O exame ao microscópio é feito geralmente por luz transmitida, o que significa que a luz deve atravessar o objeto a ser examinado. Assim, é necessária a obtenção de fragmentos dos tecidos que serão coletados em lâminas muito finas e transparentes.

Visão Geral do Processamento de Tecidos

Os tecidos a serem processados para estudo ao microscópio devem ser preparados de modo a preservar sua estrutura original ao máximo possível. Entretanto, isso não é possível e todos os preparados apresentam artefatos, que são alterações produzidas nas células pelas técnicas utilizadas. Podemos resumir os passos das técnicas histológicas com a seguinte seqüência: fixação dos tecidos, desidratação, inclusão, microtomia (corte em fatias finas), coloração e montagem de lâminas. Essas etapas serão descritas adiante.

OBTENÇÃO DO MATERIAL E FIXAÇÃO

Uma boa preparação histológica se inicia com o uso correto das técnicas de obtenção do material. Os cuidados devem ser observados já no sacrifício dos animais de laboratório para o estudo histológico de seus tecidos. Em se tratando de animais de laboratório o sacrifício pode ser obtido através de técnicas como, traumatismo brusco, intoxicação (overdose de anestésico) e perfusão/imersão.

Objetivos da fixação

A fixação paralisa o metabolismo celular e preserva as estruturas do tecido para os tratamentos posteriores. A fixação evita a autólise celular, impede a proliferação de microorganismos, leva ao endurecimento do tecido para que resista ao tratamentos posteriores. O fixador deve causar o mínimo de dano ao tecido e produzir o mínimo de artefatos. A escolha adequada da solução fixadora irá variar de acordo com o material que irá ser usado para a inclusão. A solução de glutaraldeído 2,5% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 ou a solução “formalina neutra tamponada” (NBF) são comumente usadas. Os fixadores preservam a estrutura dos tecidos ao interagirem com os grupos aminos das proteínas, através de pontes de hidrogênio. O glutaraldeído possui dois grupos aldeídos um em cada extremidade de sua estrutura molecular que podem estabelecer pontes de hidrogênio entre as proteínas. As moléculas de formaldeído, no entanto, possuem apenas um grupamento aldeído, sendo um fixador menos eficiente para alguns tipos de proteínas.

A técnica da perfusão para lavagem e fixação do tecido.

Usando anestesia profunda, em ratos e camundongos por exemplo, uma técnica que resulta em boas preparações consiste na perfusão cardíaca. Este método simula o funcionamento do sistema circulatório, uma vez que injeta os vasos do espécime com soluções químicas e perfunde os tecidos. O processo consiste inicialmente na retirada da circulação sanguínea através de lavagem feita com uma solução salina de pH neutro. Posteriormente, processa-se então a fixação através da injeção de solução fixadora. Em ambos os casos, as soluções são impulsionadas nos vasos através de tubos que se conectam à uma bomba peristáltica e à um grande vaso do animal a ser perfundido, com o arco aórtico por exemplo. Neste ponto, é importante regular a pressão de injeção da solução, que não pode exceder a pressão do sangue, pois de outro modo, artefatos por fixação são produzidos. Outro fator importantíssimo para que a técnica da perfusão seja bem sucedida é a ausência de sangue coagulado nos vasos. Para evitar esse imprevisto, é conveniente administrar heparina diluída a 1:50 (Liquenine) ao animal 10 minutos antes da etapa de sacrifício. A filtração criteriosa das soluções também é um cuidado que evita a obstrução dos pequenos vasos e o consequente iimpedimento do fluxo da solução através dos tecidos.

A técnica de fixação por imersão

Além da perfusão cardíaca, pode-se também recorrer à fixação por imersão, ainda muito utilizada. O volume de fixador empregado deve ser 15 a 20 vezes maior que o volume do fragmento de tecido a ser fixado. O fixador inicia a sua ação da periferia para o centro do material. As porções periféricas do material são primeiramente fixadas em relação as suas porções mais internas. A boa penetração de qualquer fixador está diretamente relacionada ao tamanho e espessura do material. Entretanto, de acordo com o tipo de tecido, com a fixação de um encéfalo, por exemplo, a fixação por imersão seria um método condenável, devido à dificuldade de penetração da solução. Para estes casos sugere-se recorrer ao método da perfusão.

Protocolo Soluções

 

DESIDRATAÇÃO , INCLUSÃO E MICROTOMIA

Objetivos

Para a observação ao microscópio de luz a espessura da secção do tecido presente em uma lâmina deve ser delgada o suficiente para que possa ser atravessado por um raio de luz. Para tal os tecidos devem ser criteriosamente preparados para receber um meio endurecedor, ou seja meio de inclusão. Desta forma será possível a obtenção de cortes delgados, obtidos no processo de microtomia.

Tipos de inclusões e a importância da desidratação

A inclusão pode ser feita utilizando a parafina (mais comumente usada) e as resinas plásticas, como o glicol metacrilato. Após a fixação com as soluções aquosas de glutaraldeído ou formalina, os tecidos devem ser desidratados, uma vez que a água presente nos tecidos não é miscível em substancias apolares como a parafina e as resinas de inclusão. A desidratação será feita através de imersão numa bateria de soluções alcoólicas em concentrações graduais e crescentes. A graduação pode ser iniciada, se necessário, a partir de 50% e terminando finalmente em álcool absoluto. A graduação nas concentrações é imprescindível para que ocorra a desidratação homogênia dos tecidos, evitando que ocorram danos na estrutura tecidual.

Algumas particularidades podem ser citadas quanto ao material de inclusão. caso de parafinas, o tecido deve ser tratado com uma substância de transição. A inclusão em parafina é precedida pelo uso de substâncias químicas como o xilol, este miscível tanto em álcool quanto em parafina. Após a remoção do álcool, o tecido passa por uma infiltração em parafina líquida, esta mantida em estufa a 56°C (ponto de fusão) e posteriormente o mesmo é transferido para o molde contendo parafina líquida. Em poucos minutos a parafina endurecerá e obter-se-á portanto, o "bloco" de parafina contento o fragmento do tecido em seu interior. No caso da inclusão em resina como o glicol metacrilato, o tecido é infiltrado com uma resina de infiltração por uma noite, e então incluído no molde contendo a resina ainda líquida, sendo que esta endurece após algumas horas. Como no caso da parafina, após o endurecimento, obtém-se um bloco de resina que contém o fragmento de tecido em seu interior. Os blocos serão a partir desta etapa levados para a microtomia e consequente obtenção das secções, que serão então coletadas em lâminas de vidro. No caso de inclusão em parafina, após a microtomia, o tecido é tratado com xilol novamente para remoção da parafina e rehidratado, para que possa ser submetido à coloração.

Protocolo de inclusao para parafina e metacrilato

COLORAÇÃO

Objetivo da coloração

Os cortes de tecidos apresentam-se incolores após a microtomia. A coloração visa contrastar as estruturas teciduais. A ação da maioria dos corantes se baseia na interação entre os radicais ácidos ou básicos dos elementos químicos dos mesmos com os dos tecidos. No entanto existem outros tipos de corantes, como será descrito adiante.

Corantes Ácidos e Básicos

Eosina e Hematoxilina: A hematoxilina é um corante básico que carrega uma carga positiva na porção da molécula que irá conferir cor ao tecido. Corantes básicos reagem com componente aniônicos das células e tecidos, os quais incluem grupos fosfatos, ácidos nucléicos, grupos sulfatos de glicosaminoglicanas e grupos carboxila das proteínas. A habilidade de grupos aniônicos reagirem com corantes básicos é chamada basofilia, estruturas celulares que se coram com corantes básicos são denominadas basófilas. Estruturas celulares que podem ser coradas com corantes básicos incluem heterocromatina, nucléolo, RNA ribossômico, matriz extracelular da cartilagem. A hematoxilina cora geralmente as estruturas em azul. Corantes ácidos reagem com componentes catiônicos das células e tecidos. Quando usados juntamente com corantes básicos como a hematoxilina, coram o citoplasma, filamentos citoplasmáticos e fibras extracelulares. A eosina geralmente cora as estruturas em vermelho ou rosa.

Outros exemplos:corantes ácidos: fucsina ácida, azul de anilina e orange G; básicos: azul de metileno, verde metil e azul de toluidina.

Outras técnicas de coloração

Hematoxilina e eosina são corantes adequados para evidenciar características estruturais, mas eles não são capazes de revelar todos componentes celulares. Outras técnicas de coloração são disponíveis para evidenciar diferentes componentes.

Coloração pela prata – Algumas substâncias intra e extracelulares promovem a redução do nitrato de prata que formam precipitados negros em estruturas como fibras reticulares dos linfonodos, por exemplo.

Associação de corantes - É a somatória de corantes diferentes, como o Tricrômico de Gomori, que usa verde luz, cromotropo 2R e hematoxilina

Após a coloração as lâminas são montadas ou seja, os fragmentos são protegidos pela cobertura com lamínulas de vidro. Esta é colada na lâmina através de substâncias selantes como por exemplo o Entellan. Após a secagem, as lâminas podem ser observadas ao microscópio de luz.

Protocolo para coloracao

http://www.anatomohistologia.uns.edu.ar/plantilla.asp?zona=modtecni