Extração de DNA: Método do Fenol

A extração de DNA de amostras endocervicais e ectocervicais para detecção molecular do vírus do papiloma humano (HPV) é feita baseando-se no Protocolo da Extração de DNA com Fenol. Esse processo envolve 3 etapas descritas a seguir:

Nessa primeira etapa, deve-se:

. Retirar impurezas (fungos,etc) das amostras coletadas em tubos de vidro, utilizando palito estéril.

. Vortexar os tubos para homogeneização das células.

. Centrifugar as células em 3000rpm, por 10 minutos , à 4 aC.

. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 400 microlitros de solução de lise de hemácias (SLH). Transferir para microtubo eppendorf 1,5ml.

. Centrifugar os tubos a 10000 rpm por 5 minutos para remover a hemoglobina.

OBS: Se o pellet apresentar traços vermelhos de hemoglobina, repetir a lavagem do mesmo com 400 microlitros da SLH. Caso não haja esses traços, continue o processo:

. Ressuspender as células em 300 microlitros de tampão de lise, contendo 100mg/ml de proteinase K.

. Pipetar 3 microlitros de solução Proteinase K ( 10mg/ml). Vortexar e incubar os microtubos a 55 oC por 2 horas ou 37ºC overnight.

OBS: Após o tempo, verificar se o lisado se encontra límpido para continuar a extração. Em caso de haver restos de material não digerido, adicionar mais 3 microlitros de solução de Proteinase K e repetir a digestão.

. Guardar os tubos a – 20 oC caso não continue imediatamente a extração.

. Adicionar ao lisado 1 volume(1v = 300 microlitros) de solução de fenol:clorofórmio: álcool isoamílico. Vortexar por 15-30’’, deixar os tubos em repouso por 10’’ e centrifugar por 3 minutos a 5000rpm.

. retirar o sobrenadante (SND) para outro tubo 1,5 mL e adicionar 1 volume de solução de clorofórmio e álcool isoamílico( CHCl 3 : IAA) . Vortexar por 15-30’’, repouso por 10’’ e centrifugar por 3 minutos a 5000 rpm.

. Transferir o SND para outro tubo e adicionar ao mesmo 3 volumes( 3v = 1,2 mL) de etanol 100% absoluto gelado.Neste tubo, deve-se acrescentar 1/10 do volume, ou seja, 40 microlitros de solução de acetato de sódio ( NaOAc→ 3M).

. Deixar os tubos precipitando a – 20º C overnight.

OBS: O DNA pode ficar precipitando por até 7 dias a -20º C.

. Retirar os tubos do freezer a - 20º C e colocá-los no gelo, mantendo-os gelados até centrifugação.

. Centrifugar os tubos por 20 minutos a 13000 rpm, a 4º C.

. Descartar o SND cuidadosamente.

. Lavar o pellet, se necessário, com 300 microlitros de etanol 70%.

. Centrifugar por 5 minutos, a 10000 rpm, a 4º C.

. Ressuspender o pellet de DNA em 100 microlitros de H 2O bidestilada estéril. Colocar em banho maria, a 34º Cpor 1 hora. Guardar os tubos com DNA a – 20º C.

Aviso: O fenol é corrosivo e irritante das membranas mucosas. Pode ser fatal se ingerido, inalado ou absorvido pela pele. Causa severas queimaduras e pode afetar sistema nervoso central, fígado e rim. Logo, deve-se tomar precauções durante a 2º etapa, como, por exemplo, o uso de luvas, óculos e de ventilação adequada no ambiente onde está sendo feita a extração. Além disso, também deve-se ter o cuidado necessário para o descarte do material, uma vez que o fenol é tóxico, principalmente, para a vida aquática.