Eletroforese

Gel de poliacrilamida

No laboratório utiliza-se mini-géis de poliacrilamida de 6,5%. O gel de 5ml polimeriza-se a partir da reação de:

Eletroforese

A Eletroforese, ferramenta amplamente utilizada no meio científico, é uma técnica baseada na separação de partículas em um determinado gel de acordo com sua massa e carga.. A eletroforese pode ser utilizada para separação de diversas moléculas orgânicas, como lipoproteínas, proteínas, RNA e DNA. O princípio da eletroforese utilizada para separação de DNA se baseia na carga negativa global de uma fita de DNA. Portanto, íons livres , moléculas de DNA ou fragmentos de DNA em uma solução podem ser separados aplicando–se uma certa voltagem. Ao final do processo as cadeias de DNA estarão próximas ao catodo (positivo), que atrai, devido à polaridade, moléculas de carga negativa. O gel de poliacrilamida forma uma malha constituida por uma rede de polímeros que permite a migração de moléculas. Moléculas de menor peso molecular terão mais facilidade em atravessar a malha do gel, se posicionando assim mais próximas do catodo; enquanto as moleculas com maior peso apresentam maior dificuldade e se posicionam mais próximas do anodo. A distância que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicação é comparada com a distância que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. São os marcadores de tamanho molecular (Ladders = Escadas), que são misturas de trechos de DNA com tamanhos variáveis.

Existem dois modelos básicos de eletroforese: Baseada em géis de agarose ou em géis de poliacrilamida. As duas substâncias formam tramas de poros de tamanhos variáveis, possibilitando a separação dos fragmentos, que terá sua eficiência dependente da concentração do polímero e da intensidade da voltagem e amperagem aplicada.

 

- acrilamida (C 3 H 5 NO) 30% 1,079 ml

- perssulfato de amônio(APS) 40 m l

-Catalisada por TEMED (N,N,N´,N´-Tetrametiletilenodiamino) 4 m l

- Tampão de TBE 10X 0,65 ml

- Água destilada 3,22 ml

Fig. 1 - Gel de poliacrilamida em polimerização. Pode-se visualizar o pente ainda inserido no sistema.

Solução de acrilamida 30%

- acrilamida 290 g

- Bis-Acrilamida (N,N´- Metileno-bis-acrilamida) 10 g

- Água destilada (completar para) 1000 ml


Solução de TBE 20X

 

Já a solução de TBE 20X é feita da forma que se segue abaixo e dissolvida para a concentração desejada conforme a necessidade.


- Tris Base 121,0g

- Ácido Bórico 61,7 g

- EDTA 7,9 g

- Água destilada (completar para) 1000 ml

- Ajustar pH para 8,3


Corrida do Gel

Após a polimerização, os procedimentos são:

 

•  cobertura pelo tampão de corrida (TBE 1X) na cuba de eletroforese,

•  aplicação das amostras nas canaletas (de 3 a 6,5 m l) misturadas a 1,5 m l de gel load

•  aplicação do ladder (1,5 m l)

•  aplicação da corrente elétrica que, em geral, varia de 10 a 200V.

Logo após a corrida e gel é fixado com uma solução de ácido acético, para impedir a eluição (forma borrões no gel) das amostras.

 

 

Revelação do gel

Em seguida a revelação é feita agitando o gel por:

 

- 10 minutos numa solução de ácido acético

- 3 minutos em água destilada

- 10 minutos numa solução de prata (este composto escurece quando oxidado pelo revelador)

- 30 segundos por 2 vezes em água destilada

- revelador até aparecerem as bandas do DNA


Solução de prata

- Nitrato de prata 10X (nitrato de prata 10,2g em 500 ml de água destilada) 4ml

- Água destilada (completar para) 50 ml

- Formaldeído 37 % 75 m l

 

Revelador

- Carbonato de sódio 1,5 g

- Água destilada (completar para) 50 ml

- Formaldeído 37% 75 m l

Fig. 2 - Gel de poliacrilamida corado com nitrato de prata. Devido à alta sensibilidade do método de coloração, observa-se bandas inespecíficas e DNA não amplificado na base da foto. A seta indica a corrida do Ladder

- Tiosulfato de sódio (10mg/ml de água destilada) 20 m l

A distância que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicação é comparada com a distância que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. São os marcadores de tamanho molecular ( Ladders = Escadas), que são misturas de trechos de DNA com tamanhos variáveis, normalmente eqüidistantes entre si.
Essa mistura é aplicada entre duas placas de vidro e também é posto um pente para a formação de poços.