Departamento de Microbiologia
UFMG
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Procedimentos básicos em microbiologia:
técnicas assépticas e cultivo de microrganismos

1. Técnicas assépticas

As chamadas "técnicas assépticas" são indispensáveis para o isolamento, cultivo e identificação de microrganismos. Elas têm a finalidade de evitar contaminações do meio de cultura ou dos materiais utilizados para determinado procedimento por microrganismos presentes no meio (ar, água, mãos, roupas, etc.).

A seguir, listamos algumas medidas essenciais que devem ser observadas pelo manipulador na ocasião da prática de técnicas de crescimento e isolamento de microrganismos, com o fim de preservar a pureza do cultivo e minimizar os riscos de infecção ou intoxicação no laboratório.

 

1.1 - Zona de esterilidade

As manipulações devem ser feitas dentro de uma capela microbiológica de fluxo laminar (Figura 1), que pode ser tanto de fluxo horizontal quanto vertical. O fluxo um ambiente estéril dentro da capela. Na ausência de uma capela laminar, a manipulação deve ser feita por trás da chama do bico de gás, de forma a garantir o estabelecimento de uma zona de esterilidade. É somente nesta zona estéril, que os tubos ou recipientes com meios de cultura estéreis e o material biológico a ser inoculado, deverão ser abertos ou manipulados. Qualquer outro material estéril (ex: caixa de ponteiras, seringas, potes contendo microtubos, etc.) utilizado nos procedimentos só pode ser aberto nesta área, para ser preservada a sua esterilidade.

Figura 1 - Capela de Fluxo Laminar Vertical

 

1.2 - Flambagem

 

1.2.1 - Alças de platina

Tanto a alça quanto o fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operação de semeadura ou inoculação de microrganismos. Para tanto, devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama 2 a 3 vezes. A posição correta para a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 45o em relação à mesa de trabalho (Figura 2). Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen. Para retirar o material, seja para fazer um esfregaço ou para uma semeadura, esfriar previamente a alça. Deixar esfriar nas proximidades da chama, ou em um tubo contendo água estéril.

Figura 2 - Posição correta para a flambagem da alça.

 

1.2.2 - Tubos ou frascos

Toda vez que fizer uma semeadura ou inoculação de microrganismos, utilizando tubos de ensaio, tubos de rosca ou frascos do tipo Erlenmeyer, deve-se flambar a boca dos mesmos imediatamente após a retirada da tampa (ou tampão de algodão). A tampa deverá ser mantida segura pelo dedo mínimo da mão (Figura 3). Caso esteja repicando a cultura para outro tubo, o mesmo procedimento deve ser feito com este outro tubo antes da inoculação dos microrganismos. Incliná-los, sempre, a aproximadamente 30°. No caso de tubo com ágar inclinado, este deve ficar de preferência na horizontal. Após a retirada do material com alça ou pipetas, flambar novamente a boca do tubo e colocar a tampa. Descartar as ponteiras usadas em recipientes, de preferência, contendo soluções detergentes ou desinfetantes.

Figura 3 - Posição correta para a remoção da tampa de tubos ou frascos Erlenmeyer

 

1.3 - Esterilização de materiais

 

1.3.1 - Autoclave

A autoclave é um equipamento muito eficiente para a esterilização de diversos materiais e meios de cultura. Consiste no tratamento térmico úmido sob pressão, em geral, a 121°C por quinze minutos. Como exemplos de uso da autoclave têm-se a esterilização de placas de Petri, tubos falcon, microtubos, ponteiras, meios de cultura líquidos ou contendo ágar, papéis toalha, materiais contaminados, pipetas manuais, etc. No entanto, como medidas de segurança ou para evitar estragos com os materiais e meios de cultura, alguns cuidados devem ser tomados, como por exemplo: acomodar bem os materiais e não encher demais a autoclave; deixar sair todo o vapor para então fechar a válvula de segurança; estar atento à temperatura marcada na autoclave e sempre medir o tempo transcorrido; assim que desligar a autoclave, esperar a temperatura abaixar para então abrir a válvula de escape do vapor e, quando todo o vapor sair, a autoclave pode ser aberta e o material que foi esterilizado retirado. A autoclave pode existir de diversos tamanhos e configurações, dependendo da sua finalidade (Figura 4).

  

Figura 4 - Exemplos de configurações de autoclave

 

1.3.2 - Forno de Pasteur

Algumas substâncias e materiais, como instrumentos metálicos, seringas de vidro, vaselinas e óleos, às vezes não podem ser submetidos ao calor úmido e devem ser esterilizados sob calor seco. Em geral, são necessárias temperaturas maiores e tempos de exposição mais longos para se atingir a esterilização do que os empregados na autoclave, uma vez que o poder de penetração do calor seco é menor que o do calor úmido.

 

1.3.3 - Produtos químicos

Compreende a utilização de produtos do grupo dos aldeídos, glutaraldeídos e formaldeídos. Como apresentam toxicidade, não são indicados como medida de primeira escolha, no entanto são indispensáveis para a esterilização de materiais termossensíveis, tais como artigos de nylon e teflon, luvas, tubos de borracha e outros.

 

1.4 - Desinfecção e antissepsia

A desinfecção e antissepsia consistem na descontaminação de materiais inertes e tecidos vivos, respectivamente, por microrganismos em suas formas vegetativas. Para fins de desinfecção e antissepsia, em geral, faz-se o uso de produtos químicos, Entre estes produtos, são largamente utilizados o hipoclorito de sódio, álcool etílico a 70%, soluções de iodo e aldeídos.

 

2. Cultivo de microrganismos

Os microrganismos podem ser provenientes de diversas fontes naturais ou então serem adquiridos de culturas previamente armazenadas, podendo estar refrigerados ou liofilizados. O crescimento destes microrganismos é otimizado quando inoculados em meios de cultura apropriados e mantidos em condições de temperatura, aeração e tempo de crescimento adequados. Caso não se conheça os microrganismos que estão sendo cultivados, como no caso do estudo da microbiota de determinado local, normalmente eles são isolados e identificados para então poderem ser adquiridas as culturas puras. Inúmeras técnicas de cultivo e isolamento de microrganismos podem ser empregadas e no presente texto, somente é abordada uma visão superficial dos procedimentos básicos utilizados para tais fins.

 

2.1 - Condições de incubação

As técnicas empregadas para o isolamento e cultivo de microrganismos dependem da fonte (alimentos, tecidos vivos, água, ar, etc.) e do tipo de microrganismo que se deseja isolar (enteropatógenos, bactérias lácticas, fungos filamentosos, leveduras, etc.). Por exemplo, alguns microrganismos crescem somente ou preferencialmente em condições de anaerobiose e, portanto, após o repique em meios de cultura adequados, os tubos ou placas devem ser acondicionados em câmaras de anaerobiose (Figura 5). Na ausência desta, existem outros equipamentos com o fim de manter uma atmosfera livre de oxigênio, como jarras de anaerobiose e envelope plástico para anaerobiose.

Figura 5 - Câmara de anaerobiose

 Para os microrganismos aeróbios, a incubação das placas ou tubos contendo os inóculos é normalmente feita em estufas bacteriológicas (Figura 6). Tanto em condições aeróbias e anaeróbias, o controle da temperatura é importante para se obter o crescimento dos microrganismos na taxa adequada. Enquanto muitos microrganismos crescem em temperatura ambiente ou até mesmo em condições extremas, outros têm a melhor taxa de crescimento a 37°C e, assim, devem ser mantidos em estufas com a temperatura regulada.

 

 

Figura 6 - Estufa Bacteriológica

 

2.1 - Cultivo em tubos contendo meios de cultura líquidos

Tal procedimento é bastante útil, pois possibilita a rápida e elevada multiplicação de microrganismos. Se o objetivo for o isolamento, os microrganismos podem ser crescidos nos meios de cultura líquidos adequados, seguido por semeadura em placas. A inoculação de microrganismos em meios de cultura líquidos pode ser feita com o auxílio de uma alça de platina previamente flambada ou alça descartável esterilizada, caso os microrganismos sejam provenientes de meios sólidos ou semi-sólidos, ou através de uma pipeta, normalmente quando se está fazendo o repique de uma cultura que está armazenada em meio líquido (Figura 7).

Figura 7 - Repique de uma cultura com o auxílio de pipetas automáticas

 

 

2.3 - Semeadura em placas

Na maioria dos casos, o microorganismo a ser isolado faz parte de uma população mista, sendo indispensável o seu isolamento no sentido de obtenção de cultura pura. Uma das maneiras de se obter uma cultura pura consiste no emprego da técnica de semeadura, em que são obtidas colônias isoladas de microrganismos. As colônias são caracterizadas por suas características morfológicas e, dependendo do objetivo, são cultivadas separadamente em meios sólidos ou líquidos para a posterior identificação. A técnica de semeadura também pode ser aplicada em determinados estudos com o objetivo apenas de cultivo ou para quantificar a população microbiana.

 

2.1.1. Inoculação por estrias ou esgotamento em placas de ágar

A técnica de semeadura por estrias múltiplas consiste em espalhar o material com o auxílio de uma alça bacteriológica, fazendo estrias sucessivas até o esgotamento do material, de modo a obter-se um perfeito isolamento das bactérias existentes na amostra, que após a incubação, formarão as colônias isoladas sobre a superfície do ágar. A execução é simples e devem ser tomados alguns cuidados para que realmente consiga o isolamento das bactérias.  Primeiramente, deve-se flambar a alça de platina (ou então pode-se utilizar alças de plástico descartáveis previamente esterilizadas) e introduzi-la no meio contendo as bactérias. Fazer então o estriamento na superfície do ágar da placa de Petri Após a primeira estria, flambar novamente a alça, girar a placa cerca de 30˚ e puxar nova estria. Repetir esse passo pelo menos mais 2 vezes (Figura 5). Lembre-se de que a quantidade de material a ser inoculada deve ser mínima, sendo que em muitos casos, é necessário diluir o meio do qual os microrganismos são provenientes; caso contrário, pode haver a justaposição das colônias e por isso não se pode isolá-las. 

Figura 5 - Semeadura por esgotamento em placa: segundo e terceiro conjunto de estrias

 

 2.1.2 - Método de "espalhamento" em placa

 Consiste em espalhar o material (suspensão bacteriana na maioria das vezes) com o auxílio de um swab (para obtenção de tapete uniforme) ou alça de Drigalski (para obtenção de colônias isoladas após diluição), fazendo a semeadura por toda a superfície da placa de Petri (Figura 6). Deve-se ter o cuidado de garantir que toda a superfície da placa seja semeada, evitando regiões sem semeadura. Recomenda-se que o procedimento de semeadura com o swab seja feito em três direções distintas, com diferença de 30 graus, e com a alça em toda a superfície, girando a placa.

Figura 6 - Semeadura em placa por espalhamento utilizando alça de Drigalski

 

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