Departamento de Microbiologia
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Métodos de determinação de susceptibilidade de bactérias aos agentes antimicrobianos - Antibiograma

Conteúdo

OBJETIVOS

Após a realização desta prática, você deverá estar apto a determinar o perfil de susceptibilidade de cocos Gram-positivos (Staphylococcus) a diferentes antibióticos em meio sólido, além de detectar a presença de mutantes naturalmente resistentes à ação dos antibióticos.

INTRODUÇÃO

O conceito de que grande parte das bactérias relevantes do ponto de vista clínico é resistente a agentes antimicrobianos é de extrema importância para a abordagem do quadro clínico que causam. Faz-se necessário, portanto, a avaliação do perfil de susceptibilidade das bactérias isoladas a drogas antimicrobianas (antibiograma), mesmo que se realize uma escolha empírica em um primeiro momento. Caso não seja possível colher a amostra previamente ao início do tratamento com, deve-se suspender o (s) antibiótico(s) por pelo menos uma semana para se proceder ao antibiograma.

Dispõe-se, hoje, de uma gama de métodos que objetivam a avaliação do perfil bacteriano de susceptibilidade a drogas. O método da difusão em Agar (Kirby-Bawer) avalia diretamente a atividade antimicrobiana sobre determinada amostra. Trata-se de um método clássico, bastante empregado, que se baseia no fato de que antimicrobianos impregnados em discos de papel de filtro difundem-se no ágar, criando, em torno do disco, um gradiente decrescente de concentração da droga. O teste permite classificar as bactérias como sensíveis, com sensibilidade intermediária ou resistentes aos antimicrobianos. Na aplicação desse método usam-se critérios bacteriológicos precisos para o isolamento, obtenção do inóculo e semadura dos microrganismos, bem como um número variável de discos estabelecidos em função da espécie microbiana e da infecção ou doença que provoca. Assim, visando a confiabilidade do método, deve-se atentar para os seguintes fatores interferentes: tipo de meio de cultura, inóculo, conservação dos discos de antibiótico, condições de incubação (atmosfera de O2, temperatura e tempo), observação examinador dependente (deve-se ser detalhista na procura de mutantes).

Apesar de os resultados laboratoriais apenas indicarem qual será a atividade clínica da droga, seu efeito in vivo depende de sua capacidade de atingir o local de infecção em uma dose alta o suficiente para inibir o patógeno, da natureza do processo patológico e da resposta imune do hospedeiro. O antibiograma informa que a bactéria em questão é sensível ou não ao antibiótico que foi escolhido, norteando sua manutenção ou a mudança de estratégia terapêutica. Essa informação, portanto, não garante, mas aumenta consideravelmente as chances de sucesso do tratamento. Em última análise, cabe ao clínico realizar a escolha baseando-se em seu conhecimento dos fatos pertinentes ao caso em particular, o qual será complementado pela informação do exame em questão.

MATERIAL

  • Culturas de S. aureus, em caldo simples, previamente incubadas a 37°C por 2 horas
  • Discos de antimicrobianos

  • Placas de Ágar Mueller-Hinton
  • Zaragatoas estéreis
  • Pinça

EXECUÇÃO

  • Marcar no fundo da placa de Mueller-Hinton o local onde serão colocados os discos de antibióticos, de forma a ficarem 1 cm da borda e equidistantes 2 cm aproximadamente;
  • Com os devidos cuidados técnicos embeber a zaragatoa nas culturas, eliminando o excesso de líquido por compressão nas paredes do tubo;
  • Espalhar os inóculos uniformemente na superfície de ágar, de maneira a cobrir toda superfície do meio;

  • Com uma pinça flambada e resfriada, retirar um disco de antimicrobiano do frasco, abrir a placa perto do bico de Bunsen e colocar o disco no local previamente marcado, comprimindo-o ligeiramente para que fique aderido à superfície do meio;
  • Fechar a placa;
  • Repetir o procedimento para a colocação dos demais discos de antimicrobianos;

 

  • Incubar a placa a 37° C por 24 horas.

LEITURA E INTERPRETAÇÃO

O antibiótico presente nos discos se difunde no meio de cultura sólido, atingindo concentrações decrescentes em torno do disco. A presença ou ausência de crescimento em torno dos discos é interpretada, respectivamente,  como resistência ou susceptibilidade do microrganismo ao antibiótico. As colônias no halo de inibição de crescimento são de bactérias mutantes resistentes à ação do antibiótico. Esses mutantes existem normalmente na população bacteriana devido a mutações espontâneas e o seu aparecimento não é induzido, e sim favorecido, pela pressão seletiva.

Tendo tais informações em vista, deve-se observar o crescimento bacteriano, principalmente nas áreas ao redor dos discos de antimicrobianos, e medir o diâmetro dos halos de inibição do crescimento bacteriano, anotando os resultados no quadro que se segue. A interpretação dos dados é feita com o auxílio do quadro fornecido no final do roteiro desta prática, o qual expressa a zona de inibição em mm, levando em consideração a carga antibiótica dos discos, sua difusibilidade e peso molecular.

RESULTADOS

Antibiótico utilizado

Zona de inibição
(mm)

Susceptibilidade
(S, I ou R)

Ampicilina

 

 

Cloranfenicol

 

 

Norfloxacina

 

 

Gentamicina

 

 

Penicilina

 

 

S: microrganismos sensíveis
I: microrganismos com sensibilidade intermediária
R: microrganismos resistentes

Placa de petri na qual foi realizada antibiograma para cultura de Staphylococcus aureus. Nesta foto é possível observar a formação de halo de inibição de crescimento bacteriano ao se utilizar os antibióticos norfloxacina, cloranfenicol e gentamicina. Nos três casos, considera-se o microrganismo sensível, uma vez que as zonas de inibição possuem dimensões acima daquelas que seriam observáveis se houvesse resistência. Vide tabela em anexo. Observou-se formação de pequeno halo de inibição com o antibiótico ampicilina. Ao recorrer à tabela em anexo, pode-se observar que trata-se de microrganismo resistente, uma vez que o a zona de inibição é menor que 20mm. Não se observou halo de inibição quando se utilizou o antibiótico penicilina, o que significa que o microrganismo em questão é resistente a tal antibiótico.

 

 

Anexo: TABELA PADRÃO PARA INTERPRETAÇÃO DE HALOS DE INIBIÇÃO (*). ANTIBACTERIANOS PARA ORGANISMOS GRAM-POSITIVOS E NEGATIVOS.

ZONA DE INIBIÇÃO EM mm

ANTIBACTERIANO

Símbolo

Concentração

Resistente

Intermediário

Sensível

 Amicacina

AM

30 mcg

14 ou menos

15 - 16

17 ou mais

Ampicilina  ao testar microrganismos Gram-negativos e Enterococos

AP

10  mcg

11 ou menos

12 - 13

14 ou mais

 

Ampicilina  ao testar estafilococos  e microrganismos sensíveis a penicilina

AP

10 mcg

20 ou menos

21 - 28

29 ou mais

Ampicilina  ao testar Haemophilus sp

AP

10 mcg

19 ou menos

-

20 ou mais

Bacitracina

BC

10 unid.

8 ou menos

9 - 12

13 ou mais

Carbenicilina ao testar Proteus sp e E. coli

CR

100 mcg

17 ou menos

18 - 22

23 ou mais

 

Carbenicilina ao testar P. aeruginosa

CR

100 mcg

13 ou menos

14 - 16

17 ou mais

Cefoxitina

CT

30 mcg

14 ou menos

15 - 17

18 ou mais

Cefalotina

CF

30 mcg

14 ou menos

15 - 17

18 ou mais

Cloranfenicol

CO

30 mcg

12 ou menos

13 - 17

18 ou mais

Clindamicina

CI

20 mcg

14 ou menos

15 - 16

17 ou mais

Colistina

CL

10 mcg

8 ou menos

9 - 10

11 ou mais

Eritromicina

EI

15 mcg

18 ou menos

14 - 17

18 ou mais

Estreptomicina

ET

10 mcg

11 ou menos

12 - 14

15 ou mais

Gentamicina

GN

10 mcg

12 ou menos

13 - 14

15 ou mais

Kanamicina

KN

80 mcg

13 ou menos

14 - 17

18 ou mais

Nalidixico, ácido

NA

30 mcg

13 ou menos

14 - 18

19 ou mais

Neomicina

NO

30 mcg

12 ou menos

13 - 16

17 ou mais

Nitrofurantoina

NT

300 mcg

14 ou menos

15 - 16

17 ou mais

Novobiocina

NV

30 mcg

17 ou menos

18 - 21

22 ou mais

Oxacilina ao testar estafilococos

OX

5 mcg

19 ou menos

20 - 22

23 ou mais

Penicilina G ao testar estafilococos

PN

10 unid.

20 ou menos

21 - 28

29 ou mais

Penicilina G ao testar outros microrganismos

PN

10 unid.

11 ou menos

12 - 21

22 ou mais

Polimixina

PL

300 unid.

8 ou menos

9 - 11

12 ou mais

Sisomicina

SS

10 mcg

14 ou menos

15 - 17

18 ou mais

Sulfonamidas

SF

300 mcg

12 ou menos

13 - 16

17 ou mais

Sulfatrim(sulfametoxazol  Trimetoprim)

ST

25 mcg

10 ou menos

11 - 15

16 ou mais

Tetraciclina

TT

30 mcg

14 ou menos

15 - 18

19 ou mais

Tobramicina

TB

10 mcg

12 ou menos

13 - 14

15 ou mais

Vancomicina

VC

30 mcg

9 ou menos

10 - 11

12 ou mais

(*) ADAPTADO DO NCCLS. 

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