FORMAÇÃO DE VESÍCULAS

 

Introdução

O tráfego vesicular entre os compartimentos intracelulares necessita de um mecanismo especial para garantir o movimento seletivo de proteínas e lípides a partir da organela doadora para a receptora. No geral, este problema de seleção tem sido solucionado pela concentração de moléculas "carga" específicas em vesículas que são formadas de maneira controlada e que posteriormente se fundem com a organela alvo. O primeiro passo nesta forma de tráfego é a ligação de moléculas carga ao domínio lumenal ou extracelular de um receptor transmembrana. Isto é seguido posteriormente pela concentração dos receptores através de interação com uma proteína de revestimento que é também requerida para a formação da vesícula na membrana. É provável que a concentração da molécula carga e a formação do revestimento sejam interligados a fim de assegurar um eficiente carregamento de moléculas carga em vesículas em formação.

As vesículas então se separam da membrana de origem por brotamento (budding) . Finalmente, as vesículas são direcionadas e se fundem com o compartimento aceptor. Neste capítulo, enfocou-se os recentes estudos de depressões e vesículas revestidas por clatrina, o mais bem conhecido veículo para o transporte de receptores e ligantes a partir da membrana plasmática e da rede trans-Golgi (TGN) para endossomas.

Depressões revestidas por clatrina e vesículas

O principal componente estrutural em depressões revestidas por clatrina é a clatrina. Ela consiste de 3 cadeias pesadas e 3 leves, sendo uma estrutura com três eixos (tríqueto). A

clatrina se organiza para formar uma estrutura semelhante a uma "gaiola". Estes tríquetos se reunem para formar poliedros fechados feitos de pentágonos e hexágonos. A montagem de uma gaiola de clatrina no lado citosólico da membrana plasmática ou da membrana do TGN ocorre durante a formação de uma depressão revestida (coated pit) e, como resultado final, uma porção da membrana está capturada em uma vesícula revestida. A clatrina portanto, é uma estrutura organizadora para as proteínas que fazem o direcionamento de receptores, brotamento de membrana (budding) e outros passos no ciclo de montagem de vesícula, perda do revestimento e fusão.

Figura 1: Em A está um simples complexo molecular e B mostra a agregação das moléculas de clatrina na superfície das vesículas revestidas.

As principais proteínas que direcionam a formação da rede de clatrina são as proteínas adaptadoras de clatrina (AP complex). As Aps são heterotetrâmeros que acoplam a montagem das depressões revestidas com o aprisionamento de receptores de membrana. Depressões revestidas endocíticas e vesículas revestidas contêm o complexo AP-2 enquanto os brotamentos revestidos e vesículas revestidas derivadas do TGN contêm o complexo AP-1. AP-2 contém duas cadeias maiores, as adaptinas (uma a e outra b 1 ou b 2), uma cadeia média (m 2)e uma cadeia pequena (s 2). AP-1 contém as adaptinas g e b 1 junto com as cadeias média m 1 e pequena s 1. Outros complexos já foram identificados, um novo membro da família é AP-3, um complexo encontrado em células de mamíferos que contêm as cadeias d e b 3 junto com as cadeias menores m 3 e s 3. Entretanto, acredita-se que este complexo não interage com clatrina.

Figura 2: Mostra a estrutura da AP e sua interação com clatrina

Montagem das redes de clatrina

A visão atual para o recrutamento de componentes da rede de clatrina para a membrana é que as APs são primeiramente recrutadas a partir do citosol para a membrana. Pouco se sabe sobre o processo de recrutamento das AP-2 para a membrana plasmática. O recrutamento de APs para o rede trans-Golgi (TGN) é influenciado pelo fator de ribosilação-ADP(ARF) e GTPg S. A presença de caudas receptoras (nos receptores a serem endocitados), que interagem com os APs, também estimulam o recrutamento de AP-1 para a rede trans-Golgi. Entretanto, as caudas receptoras provavelmente não são as únicas determinantes responsáveis pelo direcionamento dos APs para a membrana, pois elas estão presentes em compartimentos nos quais as APs não são normalmente recrutadas. Portanto, um aparato de ancoragem de alta afinidade ligado a membrana tem sido postulado (figura3). Após a ligação dos APs aos receptores de membrana, ocorre a ligação da clatrina para formar o revestimento. Este processo é altamente coordenado e parece envolver pelo menos 60 trímeros de clatrina e 20 a 30 Aps. Várias evidências sugerem que a clatrina liga-se a subunidade beta dos APs. As cadeias beta de AP-1 e AP-2 possuem um domínio amino-terminal central e uma "orelha"carboxi-terminal que são ligadas por uma dobradiça. A interação com a clatrina é mediada pela dobradiça. A fosforilação da dobradiça parece prevenir a associação de AP-2 com clatrina e isto pode ser parte do mecanismo pelo qual APs iniciam e coordenam a formação do revestimento de clatrina. Interessantemente, a cadeia b 3 de AP-3, encontrado em associação com membranas endossomais, falta o motivo de ligação à clatrina na região de dobradiça.

Figura 3:O reconhecimento de sinais endocíticos baseados em tirosina em receptores transmembrana por complexos AP-2 é acentuado por revestimento de clatrina e 3'fosfoinoitídeos. A figura mostra o modelo proposto para a captura de receptores ligados à membrana pelo revestimento de clatrina. (a) (i) Os complexos AP-2 são inicialmente direcionados a partir do citosol para a membrana plasmática pela interação com seu provável complexo de ancoragem ligado a membrana. (ii) Neste ponto, a AP-2 interage com clatrina citosólica para formar a rede revestida por clatrina. (iii) AP-2 situada nas redes parcialmente formadas sobre um aumento, dependente de clatrina, na afinidade de sua cadeia média m 2 com a cauda dos receptores transmembrana. ( Este aumento está representado pela mudança da forma triangular para a retangular na AP-2. (iv) Este aumento leva a uma captura dos receptores cargo móveis (v) dentro da rede de clatrina. É proposto que a união entre a clatrina e Aps e o aumento da afinidade das Aps pelo receptores garante que a montagem da rede de clatrina é acoplada ao direcionamento do receptor. (b) (i) Complexos AP-2 conduzidos para a membrana plasmática por um provável complexo de ancoragem de AP pode (ii) interagir com 3'fosfoinositídeos ( Ptdlns 3P) ligados a membrana, levando a um aumento na afinidade da cadeiam 2 da AP-2 para o sinal endocítico baseado em tirosina localizado na cauda citoplasmática dos receptores cargo transmembrana. O receptor é mostrado ligado a AP-2(iii). O complexo receptor-AP-2 recruta clatrina citosólica para formar a rede ou pode ser capturado pela clatrina disponível já localizada no limite da depressão revestida.

Um componente recentemente descoberto nas depressões e vesículas revestidas por clatrina é o "Eps15" originalmente definido como um substrato fosforilado pelo receptor do fator de crescimento epidermal. Eps15 se liga à cadeia alfa da AP-2 e colocaliza-se com clatrina na membrana plasmática. O papel da Eps15 na formação dos revestimentos ainda é incerto; seu segmento c-terminal tem um sítio de ligação para a "cadeia" alfa da AP-2 e seu n-terminal contém três domínios homólogos a Eps (EH) que são módulos de 70-90 aminoácidos presentes em diversas proteínas de levedura, incluindo End3p e Pan1p. Estas proteínas são requeridas para a endocitose e organização de citoesqueleto de actina.

 

 

Figura 4: Em A uma visão geral da depressão revestida e a montagem para a formação a vesícula. Em B tem-se uma figura de microscopia eletrônica mostrando a estrutura da vesícula que foi endocitada ia rede de clatrina.

Sinais de internalização

Os componentes da rede de clatrina estão em uma posição que os permite interagir com as caudas citosólicas dos receptores transmembrana, as quais possuem sinais específicos que governam a sua rápida internalização e outros processos de direcionamento intrancelular. Estes sinais são seqüências ou motivos estruturais e muitos deles possuem ou um resíduo de tirosina crítico ou um par de leucinas ou grandes resíduos hidrofóbicos e são chamados sinais de tirosina ou sinais dileucina.Existem várias evidências de que os sinais baseados em tirosina se ligam diretamente ao complexo AP-2 e que esta ligação é o evento que promove a concentração de certas proteínas da membrana plasmática dentro de depressões revestidas por clatrina. Outros estudos sugerem que os sinais baseados em dileucina também interagem com AP-2. Como seria esperado para os passos dependentes de interação com um l número imitado de moléculas reconhecedoras, a internalização mediada por ambos os sinais, tirosina e dileucina, é um processo saturável. Uma importante característica destes sinais é que um subgrupo destes sinais está envolvido com processos adicionais de direcionamento tais como direcionamento para lisossomos, compartimentos endosomal/lisossomal, a rede trans-Golgi ou a membrana plasmática basolateral de células epteliais polarizadas. Portanto, aparentemente, alguns destes sinais são reconhecidos em sítios intracelulares diferentes da membrana plasmática, possivelmente por complexos adaptadores tais como AP-1 ou AP-3.

Estudos demonstram que os sinais de internalização são muito mais diversos do que se pensava. Porém, a diversidade de sinais pode ser uma característica crítica da maquinaria de direcionamento de vesículas revestidas por clatrina. Como a habilidade para concentrar em depressões revestidas por clatrina pode não requerer alta afinidade, é possível que mesmo interações fracas de seqüências ainda não descritas com AP-2 ou com outros componentes da rede de clatrina possa ser suficiente para efetivar a internalização.

A organização do revestimento com múltiplas cópias de AP-2 imobilizadas em uma gaiola de clatrina e a tendência de algumas proteínas de membrana plasmática para oligomerizar pode fornecer as condições para a geração de uma ligação forte, a partir de interações que são fracas em nível bimolecular. A combinação de diversos sinais de internalização dentro da mesma cauda citosólica do receptor pode também permitir uma ligação multivalente a AP-2. De fato, sinais baseados em tirosina, dileucina e grupos ácidos(tabela1 no artigo original) são freqüentemente encontrados em combinação; o exemplo mais notável é encontrado em dois receptores de manose-6-fosfato que possuem todos os três tipos de sinais.

Reconhecimento de sinais baseados em tirosina pela AP-2

Este sinal foi o primeiro a ser descoberto e é o mais comumente encontrado entre as proteínas que são rapidamente internalizadas. Sinais baseados em tirosina são caracterizados pela presença de um resíduo de tirosina em uma posição crítica na cauda dos receptores. Extensas análises vem sendo feitas para se conhecer a importância dos resíduos vizinhos a esta tirosina. As regiões consenso mais comuns a esta vizinhança são: NPXY e YXXf (X representa qualquer aminoácido e f representa aminoácidos hidrofóbicos grande ( tabela 1). Por causa da variabilidade posicional deste resíduos, ele podem acabar determinando a afinidade e especificidade da interação dos sinais com diferentes adaptadores e, consequentemente podem determinar a taxa de internalização de diferentes proteínas assim como a probabilidade com que as proteínas irão passar pelo direcionamento em alguns compartimentos intracelulares.

Estudos in vitro tem demonstrado uma interação direta deste sinal com AP-2. Ensaios com a técnica do duplo híbrido tem identificado a cadeia média da AP-2 m 2, como molécula que reconhece os sinais baseados em tirosina. Verificou-se que esta cadeia é capaz de se ligar a muitos diferentes sinais de tirosina, embora exista uma preferência de ligação a sinais que possuem resíduos básicos na posição X.

Regulação da interação dos sinais baseados em tirosina com a AP-2

A escolha das proteínas da membrana plasmática que estão contidas dentro das depressões revestidas pela clatrina, pode ser regulada por modificações dos sinais baseados em tirosina e/ou complexo AP-2. Em relação aos sinais baseados em tirosina, a fosforilação da tirosina tem mostrado anular as interações com m 2/AP-2. Acredita-se que esta modificação tenha um papel importante na regulação da internalização do CTLA4 (T cell co-receptor cytotoxic T lymphocyte antigen 4). A fosforilação de outros resíduos, externos ao sinal de tirosina poderia modificar o contexto conformacional local, tornando o

sinal mais ou menos acessível para interações com AP-2. Um outro determinante das interações pode ser o estado oligomérico das proteínas da membrana plasmática uma vez que a aproximação de dois ou mais sinais poderia causar um aumento da avidez para os complexos AP-2 imobilizados. Todos esses processos podem ser disparados pela ligação de ligantes a receptores endocíticos, o que poderia funcionar como um meio de regulação da concentração do receptor dentro das depressões revestidas pela clatrina com base no estado de ocupação dos receptores.

Modificação de AP-2 pode ser uma outra via para regular o reconhecimento de sinais baseados em tirosina. Evidências indicam que a ligação de AP-2 à "gaiola" de clatrina aumenta a afinidade de AP-2 por peptídeos que codificam sinais baseados em tirosina. Este aumento é, provavelmente, devido à mudança conformacional do complexo AP-2 induzida pela interação com a clatrina. A possível conseqüência desta modulação da afinidade é que os receptores endocíticos são preferencialmente recrutados por AP-2 que está pré-agrupada com clatrina (FIG. 3). Tem também sido mostrado que o complexo AP-2 sofre fosforilação in vivo e, isto pode ser interessante para se examinar se esta fosforilação afeta o reconhecimento de sinais baseados em tirosina. Os Aps são grandes complexos proteícos que podem responder a um sinal adicional. Tem sido, recentemente, observado que fosfoinositídeos 3'-fosforilado acentuam a interação de AP-2 com sinais endocíticos baseados em tirosina. Esta descoberta pode auxiliar na explicação da importância das 3'-fosfoinositideos cinases no tráfego de membrana. (FIG.3).

beta-Arrestina como um adaptador de clatrina

Até recentemente, todo o acumulo de proteínas endocíticas dentro das depressões revestidas pela clatrina era explicado com base nas interações com AP-2. Um estudo publicado recentemente, oferece um exemplo de uma outra via de ligação de proteínas endocíticas para redes de clatrina. O estudo mostra que a ligação de um agonista ao receptor b 2-adrenérgico causa a fosforilação do receptor seguida pela ligação da proteína citosólica b -arrestina no domínio citosólico do receptor. A b -arrestina interage diretamente

com a clatrina conduzindo à concentração do receptor nas depressões revestidas e sua subsequente internalização. Essas observações sugerem que a ligação de AP-2 não é um requerimento obrigatório para concentração dentro das depressões revestidas pela clatrina e que outras vias de ligação a receptores para clatrina podem ser igualmente capazes de mediar a internalização. Este mecanismo pode ser relevante para outros receptores acoplados à proteína G e receptores de transdução de sinal. Além disso, é aceitável que receptores com grandes domínios citoplasmáticos podem ser capazes de alcançar o interior da gaiola de clatrina sem a necessidade de moléculas intermediárias.

Paralelo do transporte de vesículas revestidas com clatrina com o

transporte entre retículo endoplasmático e Golgi.

Sabe-se, há alguns anos, que diferentes proteínas secretórias saem do RE em diferentes taxas. Com a descoberta do sistema de controle de qualidade no lúmem do RE pensou-se que essas diferenças nas taxas de transporte eram explicadas pela retenção das proteínas devido as suas diferenças no processamento, enovelamento ou a montagem no RE. Entretanto, recentemente, demonstrou-se que proteínas carga são concentradas em sítios de saída ou vesículas que brotam do RE. Mais recentemente, uma nova classe de pequenas proteínas com homologia a proteína Emp24p de levedura tem sido encontrada e essas proteínas poderiam desempenhar um papel neste evento de concentração.

Estudos mostram que a mutação em Emp24p de Saccharomyces cerevisiae tem um efeito deletério no transporte do RE para o Golgi de somente algumas proteínas secretórias. Para uma das proteínas afetadas,a invertase, foi mostrado que este efeito não foi devido a um atraso no enovelamento ou oligomerização. Emp24p foi concentrada nas vesículas revestidas pela COPII, derivadas do RE. Este fato leva à hipótese de que proteínas relacionadas à Emp24p atuam para concentrar moléculas carga dentro de vesículas de brotamento. A mutação de Emp24p também causou secreção de Kar2p, uma chaperone do lúmem do RE, e poderia suprimir a deleção do gene SEG13 que codifica um componente das vesículas revestidas pela COPII. Concluiu-se que Emp24p é requerida para a formação eficiente da vesícula, alguns outros membros desta família tem sido encontrados; a primeira, gp25L, co-purificada com calnexina. Outros membros tem sido isolados de vesículas revestidas de COPII e COPI. Em todos os casos, os membros da família Emp24 são os principais componentes das vesículas, sugerindo que eles tenham uma função importante.

Todos os oito membros da família Emp24 de levedura são proteínas de membrana do tipo I que apresentam mais ou menos 20-25% de identidade de seqüência. A l região mais variável é a encontrada na extremidade amino-terminal da molécula e o resultado desta diversidade, pode estar envolvido na ligação seletiva da carga. Há dois resíduos de cisteína altamente conservados neste domínio que são característicos de receptores de tráfego de proteínas. Seguindo este domínio está uma região de estrutura coiled-coil que pode estar envolvido em reações de associações de proteínas. Evidências claras têm sugerido que dois membros da família de leveduras, Emp24p e Erv25p, são funcionalmente e fisiologicamente associados um com o outro. A porção próxima à membrana do domínio lumenal é altamente conservada, sugerindo que pode desempenhar um papel comum entre os diferentes membros. Os domínios transmembranas dos membros da família Emp24 são também conservados e tipicamente contém resíduos polares. Esses domínios relativamente polares, são, provavelmente, associados com domínios transmembranas de outras proteínas, talvez outros membros da família Emp24, para mascarar esses resíduos polares. Finalmente, a cauda citoplasmática dessas proteínas são variações de um tema comum. Todas elas têm uma glutamina conservada que pode ser encontrada na interface membrana-citosol. A sequência próxima a membrana pode formar uma hélice amfipática, com resíduos hidrofóbicos, 3 resíduos depois da glutamina e 1 ou 2 resíduos de fenilalanina conservados. Três membros da família Emp24 contêm uma típica sequência de localização no RE de motivo dilisina KXKXX, quatro contém resíduos básicos próximo a extremidade carboxi-terminal e um Emp24 contém resíduos não básicos perto da extremidade carboxi-terminal. É bem provável que o papel da cauda citoplasmática seja a ligação de proteínas citoplasmáticas de revestimento, provalmente COPI e COPII. Se estas proteínas atuam como receptores de carga para tráfego entre Retículo endoplasmático e complexo de golgi, elas devem transitar entre duas organelas.

Experimentos recentes tem estudado a interação de caudas citoplasmáticas de diferentes proteínas da família Emp24 com COPI. Estes estudos sugerem que diferentes sequências de caudas ligam-se a diferentes subcomplexos de COPI. Caudas com motivos de dilisina ligam-se a a , b ' e e COP (sub-complexo B), enquanto sequências sem motivos dilisina ligam-se a b , g e x COP (subcomplexo F). A última ligação foi dependente da seqüência FF na cauda enquanto a primeira não. Um outro estudo examina a ligação de uma cauda com resíduos básicos que não estavam em porções conservadas típicas dos motivos lisina. A substituição de resíduos básicos ou FF influenciaram a ligação de COPI , mas os efeitos foram mais significativos quando o motivo FF foi substituído. Nenhum subcomplexo COPI foi visto nesse estudo . A comparação de interações das caudas com ambos os complexos COP e experimentos de mutagênese controlada podem ser necessários para o entendimento do papel dessas caudas citoplasmáticas no transporte de proteínas.

Conclusão

Nos últimos anos nós temos testemunhado um aumento significativo no conhecimento de como moléculas carga, ligadas a receptores, são concentradas dentro de vesículas em formação através de interações da cauda do receptor com as proteínas de revestimento das vesículas. Um conjunto diverso de sinais na cauda do receptor pode mediar essas interações. Mesmo para o melhor sistema descrito, a via baseada na clatrina, a sequência precisa de eventos na formação das vesículas ainda necessita ser mais bem estudada. Durante ou após a interação recptor-adaptador, o revestimento é construído de maneira coordenada. Novas proteínas que participam nesse processo estão ainda sendo descobertas. Nós estamos apenas começando a entender a regulação da montagem do revestimento pela clatrina por modificação de proteínas e moléculas regulatórias. Aparentemente, existe um mecanismo semelhante de transporte de moléculas carga a partir do RE. Entretanto, novos experimentos serão ainda necessários para examinar a concentração das moléculas carga nessa organela.

Questões:

1- É uma característica da clatrina, exceto:

A)Possui uma estrutura trimérica

B)Liga-se diretamente às moléculas cargas

C)Atua na formação das "coats pits"

D)Possui interação com proteínas adaptadoras

2-Sobre as proteínas adaptadoras de clatrina é incorreto afirmar, exceto:

A)São estruturas heterotetraméricas que direcionam a formação da rede de clatrina

B)Esta família de proteínas adaptadoras é composta de 5 membros: AP1, AP2, AP3, AP4 E AP5

C)AP3 é a proteína adaptadora com maior afinidade de ligação com clatrina

D)AP2 é a única entre as APs que é trimérica

3-Sobre o recrutamento de APs para a membrana, é incorreto afirmar:

A)São as primeiras a serem recrutadas do citosol para a membrana

B)Os mecanismos de recrutamento das APs necessita de fosforilação por PKC

C)O recrutamento das APs para a rede trans-Golgi é influenciada por GTPgS e fator de ribosilação-ADP

D)Os receptores transmembrana não são os únicos responsáveis pelo direcionamento das APs para a

membrana

4-No passo de montagem dos revestimentos de clatrina, aponte a questão errada:

A)A clatrina irá se ligar aos complexos AP ligados à membrana

B)As cadeias beta das AP-1 e AP-2 são suficientes para interagir com clatrina e direcionar a formação

das coats

C)Eps15 é um substrato fosforilado pelo receptor fator de crescimento epidermal e se liga a caeia

alfa da AP-2

D)Duas questões estão erradas

5-Sobre os sinais baseados em dileucina e tirosina é incorret afirmar, exceto:

A)São motivos presentes no domínio lumenal ou extracelular dos receptores transmembrana

B)Sinais baseados em tirosina ligam-se diretamente a clatrina

C)Sinais baseados em tirosina e dileucina são os únicos motivos conhecidos que estão envolvidos com

endocitose

D)Todas as alternativas acima estão erradas

Gabarito:

1B/2A/3B/4D/5D

Artigo original Formação de vesículas

Bibliografias adicionais:

Stryer,segunda edição,1994

Endocitose mediada por receptor



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