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DNA POLIMERASE I

Atividade processiva:

Foi a primeira enzima dirigida por um molde a ser descoberta.

A DNA polimeraseI não é a enzima que replica a maiorparte do DNA em procariotos. Entretanto, ela tem um papel crítico na replicação,e também no reparo de DNA.

A DNA polimeraseI , um monômero de 103 Kd catalisa a adiçãopasso a passo de unidades de desoxirribonucleotídeos a ponta 3' de uma cadeiade DNA: (DNA)n nucleotídeos + dNTP = (DNA)n+1 + PPi / d é qualquerdesoxirribonucleotídeo 5' fosfato.

A DNA polimerase I requer todos os quatro desoxirribonucleotídeos 5' trifosfatos - dATP, dGTP, dTTP, dCTP e magnésio para a síntese de DNA. A enzima adiciona desoxirribonucleotídeos às extremidades 3'- OH livre da cadeia que está sendo alongada, que ocorre no sentido 5' para 3'.

 

 

 

Um molde de cadeia (primer) com uma 3'- OH livre é necessário no início da replicação.

Também é essencial um molde de DNA contendo uma região unifilamenttar. A polimerase catalisa o ataque nuceofílico do terminal 3'- OH do primer no átomo de fósforo mais interno de um dNTP. É formada uma ligação fosfodiéster, sendo liberado um pirofosfato. A reação é ativada pela hidrólise subsequente de PPi pela pirofosfatase inorgânica.

A polimerização é catalisada por um único centro ativo que pode ligar-se a qualquer um dos quatro dNTPs. Qual o que se liga irá depender da base correspondente no filamento molde.

 

 

A probabilidade de ligação e de fazer a ligação fosfodiéster é muito baixa, a menos que o nucleotídeo que chega forme um pareamento de bases tipo Watson e Crick com o nucleotídeo oposto no molde.

 

 

 

 

 

Atividade exonucleásica revisora 3'-5':

A DNA polimerase I também catalisa a hidrólise de nucleotídeos não pareados um de cada vez, na ponta 3' das cadeias de DNA ( atividade de exonucleasse 3'-5'). O centro ativo de exonuclease é diferente do da polimerase.

 

 

A atividade de exonuclease da DNA polimerase I tem uma função de revisão na polimerização.

 

Na figura há um C (citosina) não pareada na ponta de uma sequência de timidinas que formam uma dupla hélice com uma sequência mais longa de nucleotídeos com adenina (A). A DNA polimerase I excisa o dCMP, e uma 3'- OH é exposta no terminal T do filamento molde. Então mais timidinas são adicionadas. Em geral, a DNA polimerase I remove nucleotídeos mal pareados no terminal do primer antes de continuar a polimerização. Essa atividade de exonuclesa 3'- 5' aumenta acentuadamente a precisão da replicação do DNA.

A DNA polimerase I examina o resultado a cada polimerização que ela catalisa antes de passar para a próxima. A frequência de erro da enzima é de10-7. O produto da frequência de um mal pareamento inicial é 10-4, e a frequência de erro na revisão é 10-3.

 

ATIVIDADE EXONUCLEÁSICA 5'- 3' CORRETORA DE ERROS:

- A atividade exonucleásica 5'-3' é muito diferente da 3'-5':

- A clivagem pode ocorrer na ligação fosfodiésterterminal ou em uma ligação distante de vários nucleotídeos do terminal 5'. A ponta 5' pode teruma hidroxila livre ou pode ser fosforilada.

- A ligação clivada tem de estar em uma regiãode dupla hélice.

- A atividade de exonuclease 5'-3' é aumentada pela síntese concomitante de DNA.

- O centro ativo para a ação de exonuclease énitidamente separado dos centros ativos para a polimerização e hidrólise 3'-5'.

 

Essa atvidade exonucleásica 5'-3' é importante pela remoção do primer e para revisão de erros como dímeros de pirimidinas (formados pela exposição aos raios UV). Visite o sítio sobre REPARO DE DNA.

A DNA polimerase tem 3 centros ativos diferentes sua cadeia polipeptídica:

 A- Polimerização,

 B-  exonuclease 3'-5',

 C-  exonuclease 5'-3'.

Essa enzima trifuncional pode ser dividida por proteases em um fragmento de

36 Kd com toda a atividade original de exonuclease 5'-3', e um fragmento grande de 67 Kd (Klenow) , com todas as atividades de polimerase e da exonuclease3'-5'.

 

 

A polimerização e a revisão podem ocorrer quase que simultaneamente sem que o DNA se separe da enzima, pela proximidade entre o centro de ação exonucleásica 3'-5' e o de polimerase, porque assim, permite que o terminal 3' da cadeia em crescimento desloque-se para trás e para frente entre eles.

 

 

DNA PARENTAL É DESENROLADO, E UM NOVO DNA É SINTETIZADO NA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO.

A molécula de DNA mantém sua forma circular enquanto está sendo replicada (procarioto). A síntese do novo DNA está bem acoplada ao desenrolamento do DNA parental. Um local de desenrolamento e síntese simultânea é chamado de forquilha de replicação.

 

 

UM FILAMENTO DE DNA É FEITO DE FRAGMENTOS, E O OUTRO E SINTETIZADO DE MODO CONTÍNUO.

Na forquilha de replicação, ambos os filamentos do DNA parental servem como moldes para a síntese do novo DNA. O sentido geral da reação para um filamento filho é 5'-3'e para o outro 3'-5'.

 

 

As DNA polimerases sintetizam somente no sentido 5'-3'. Por isso uma uma significativa proporção de DNA recém sintetizado existe como pequenos fragmentos. São chamados de fragmentos de Okazaki no sentido 5'-3'. A medida que a replicação continua, estes fragmentos tornam-se covalentemente unidos pela DNA ligase para formar um dos fragmentos filhos.

 

 

O filamento formado pelos fragmentos de Okazaki é chamado de filamento "laggin". Enquanto o sintezado sem interrupção é o filamento "leading".Tantos os fragmentos de Okazaki quanto os leadding são sintetizados no sentido 5'-3'. A reunião descontínua do filamento lagging possibilita a polimerização 5'-3' ao nível de nucleotídeo, originando um crescimento geral no sentido 3'-5'.

 

 

A REPLICAÇÃO COMEÇA COM O DESENROLAMENTO DO LOCAL ORI c

(ORIGEM).

A DNA polierase III se situa então na forquilha de replicação ondddde começa a síntese do filamento "leading" usando o primer re RNA formado pela primase.

 

 

A helicase movida por ATP desenrola o dúplex de DNA a frente da polimerase.

Até a replicação ser completada, o filamento leading é sintetizado continuamente pela DNA polimeraseIII, e só então depois de terminada é que o molde é liberado.

O filamento lagging é sintetizado em fragmentos, de modo que a polimerização no sentido 5'-3'leva a um crescimento geral no sentido 3'-5'. Isto pode ser obtido por uma alça no filamento lagging.

 

 

 

O molde do filamento lagging passaria então pelo centro de polimerase em uma subunidade de uma polimerase III dimérica no mesmo sentido que o molde do filamento leading na outra subunidade. Após cerca de 1000 nucleotídeos adicionados ao fragmento a DNA polimerase III deixa o molde de filamento lagging, assim repetidamente formando novas alças para formação de outros fragmentos de Okazaki.

A DNA polimerase I preenche os espaços entre os filamentos lagging. Esta enzima também usa atividade de exonuclease 5'-3'para remover o primer de RNA que ficou a frente ddo centro de polimerase. Então a DNA ligase une os fragmentos.

 

 

 

 

UM PRIMER DE RNA SINTETIZADO PELA PRIMASE PERMITE QUE A SÍNTESE

DE DNA COMECE

O lócus oriC tem 245 pb no cromossomo de E. coli . Possui 13 sequências quase idênticas em 3 blocos. Cada um começa com GATC, uma sequência que aparece 11 vezes em oriC . Esses 13 blocos são ricos em A-T, facilita a separação  do dúplex para começar a síntese de DNA . A metilação da adenina em GATC pode ser importante no controle quando começa a replicação.

A ligação da proteína dna A a quatro locais em  oriC próximo a esses grupos de 13 inicia um intrincado processo de etapas que levam ao desenrolamento no molde de DNA e síntese de um primer  ( precisa de superelicoidização negativa )  . Dna B e dna C se juntam à dna A e auxiliam na abertura da hélice. A parte desenrolada é estabilizadapor SSB (proteína). O alívio  da superelicoidização positiva para que a síntese de DNA continue é fornecido pela DNA girase.

 

 

OS FILAMENTOS FILHOS "LEADING E LAGGING" SÃO SINTETIZADOS

SIMULTANEAMENTE PELA HOLOENZIMA.

A primase ( uma RNA polimerase especializada) junta-se ao pré- primer em uma montagem de mútiplas subunidades chamada primossomo. A primase sintetiza um filamento curto de RNA, que é complementar a um dos filamentos moldes de DNA.

 

 

O primer de RNA é removido ao final da replicação pela atividade de exonuclease 5'-3'da DNA polimerase I.

As RNA polimerases podem iniciar cadeias de novo porque não examinam o par de bases precedente. A síntese de DNA começa com um trecho de polinucleotídeos de baixa fidelidade, que é  "temporário"  pela adição de ribonucleotídeos a ele.