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INTRODUÇÃO

Embora a mutação seja uma das principais fontes para a evolução, a estabilidade do material genético também é fundamental para a continuação da vida. O DNA está exposto a uma série de agentes físicos, como luz ultravioleta (UV), e químicos que provocam lesões nessa molécula. Caso não sejam removidas, essas lesões podem levar a mutações ou à morte celular.
Os organismos desenvolveram uma série de mecanismos capazes de remover lesões e, com isso, manter uma maior estabilidade do material genético. Existem mecanismos que fazem a reversão da lesão, como é o caso da enzima fotoliase que desfaz dímeros de pirimidina na presença de luz. Outros mecanismos removem a lesão, independentemente da luz.
O estudo do DNA no homem sempre esteve muito associado a doenças humanas relacionadas ao reparo de DNA. Um dos primeiros avanços nesta área de pesquisa foi feita por James Cleaver em 1968, quando ele demonstrou que as células de pacientes com a síndrome do xeroderma pigmentosum (XP) são deficientes no reparo por excisão de nucleotídeos.

 

Cinco tipos de reparo de DNA são conhecidos:
1. Mismatch repair
2. Reparo por excisão de bases(BER)
3. Reparo por excisão de nucleotídeos (NER)
4. Reparo direto
5. Reparo por recombinação

Também tem o reparo de dna em organelas que é explicado logo abaixo.

 

Mismatch repair
Este sistema repara os mal pareamentos das bases do DNA gerados por erros de replicação. Em E. coli, mismatch repair é direcionado por metilação de sequências GATC na fita que é sintetizada após a replicação. Além da DNA polimerase, SSB (single strand binding protein), helicase, exonuclease e DNA ligase três enzimas especializadas - mut S, mut L e mut H - são requeridas. O mut S se liga nas bases mal pareadas.O mut H se liga na sequência GATC. Se somente uma das fitas é metilada no GATC,  a proteína mut H  atua como endonuclease sítio-específica clivando a fita não metilada na porção 5' do G no GATCmarcando a fita para ser reparada. A proteína mut L se liga ao mut S e mut H do complexo. Uma vez  que a clivagem ocorreu, a fita de DNA não metilada é degradada do sítio de clivagem até a região de mal pareamento e replicada com DNA novo. Esta fase final utiliza o restante das enzimas listadas acima. Um sistema muito similar de reparo de bases mal pareadas existe nos eucariotos incluindo o homem (Figura 1).

 

Reparo por excisão de bases(BER)

Este processo é conduzido pelas enzimas  DNA glicosilases que reconhecem os produtos de citosina e adenina deaminadas no DNA gerando uracila e hipotanina. Esse tipo de reparo tem início com a ação de DNA glicosilases que reconhecem e removem bases lesadas da cadeia do DNA pela quebra da ligação N-glicosil, a qual mantém a base nitrogenada associada com o esqueleto de açúcar-fosfato (Friedberg et al., 1995). As enzimas com atividade de DNA glicosilase foram inicialmente estudadas e caracterizadas em E. coli, mas atualmente diferentes DNA glicosilases foram caracterizadas em eucariotos e essas apresentam grande homologia com as enzimas procariotas. A maioria das DNA glicosilases reconhecem lesões específicas como a adenina metilada na posição 3 (Steinum & Seeberg, 1986) ou a 8-hidroxiguanina (Boiteux et al., 1987).
Após a retirada da base lesada gera-se no DNA um sítio apurínico ou apirimidínico (AP) que será reparado por AP endonucleases (Doetsch & Cunningham, 1990). Os sítios AP também podem ser gerados por hidrólise natural do DNA. Todas as AP endonucleases conhecidas até o momento realizam a quebra do esqueleto açúcar-fosfato na região 5’ deste. O resultado dessa quebra gera duas terminações: uma 3’-OH e outra 5’-fosfato-desoxirribose.
A E. coli apresenta duas AP endonucleases: exonuclease III (xth) e endonuclease IV (nfo). A exonuclease III foi inicialmente caracterizada como uma exonuclease com uma atividade associada de fosfatase (Doetsch & Cunningham, 1990). Atualmente, sabe-se que a principal função fisiológica dessa proteína é a atividade de 5’ AP endonuclease. Essa enzima  tem aproximadamente 28 kDa e é capaz de atuar eficientemente tanto em sítios apurínicos quanto  apirimidínicos (Gossard & Verly, 1978).
Por sua vez, a endonuclease IV de E. coli não é detectada em extrato bruto de células selvagens, uma vez que ela é responsável por somente 10% da atividade de AP endonuclease em extratos brutos (Ljungquist, 1977). Essa enzima apresenta atividade AP endonuclease semelhante à exonuclease III.
Após a ação das AP endonucleases é necessário que ocorra a remoção de resíduos 5’-fosfato-desoxirribose. Essa etapa é realizada pela enzima DNA desoxirribo-fosfodiesterase (dRpase), para que uma DNA polimerase possa reconhecer e complementar a lacuna gerada pela retirada do nucleotídeo (Friedberg et al., 1995).
A similaridade e conservação entre os genes de eucariotos e procariotos é também funcional, já que genes de eucariotos são capazes de complementar  bactérias deficientes em genes envolvidos no reparo por excisão de base (Friedberg et al., 1995). A possibilidade dessa complementação ocorrer advém do fato das enzimas que atuam nesse tipo de reparo reconhecerem lesões específicas e não precisarem montar um complexo enzimático para a retirada da base lesada. (Figura 2)

 

Reparo por excisão de nucleotídeos (NER)

Este sistema, que tem sido estudado com maior ênfase em bactérias, repara vários tipos de lesões, incluindo dímeros de ciclobutil pirimidina e dímeros 6-4 de piridimidina induzidos pela radiação ultravioleta (luz UV).A enzimas chave formam um complexo chamado de endonuclease de excisão ABC ( produto dos genes uvrA, uvrB e uvrC). Ao se ligar no DNA no sítio da lesão causada pelo agente físico o complexo ABC cliva a fita contendo a lesão duas vezes, em cada lado da mesma.A lesão é removida do DNA como parte de um resíduo de 12 a 13 oligonucleotíos. O s detalhes da reação são os seguintes: uvrA é a enzima de reconhecimento da lesão. Ela forma um complexo A2B1 com uvrB, se liga no sítio da lesão, desenrola o DNA causando uma modificaçZão comformacional em uvrB que facilita a sua adesão no sítio da lesão. uvrA se dissocia do complexo uvrB-DNA, que forma um sítio específico para a ligação da enzima uvrC. Com a ligação de uvrC, uvrB faz uma incisão 3'que causa uma mudança comformacional no complexo, facilitando uvrC a fazer uma incisão 5". A remoção da lesão requer a ação da helicase, Helicase II (uvrD), que retira o oligomero excisado e uvrC e o "gap" que resulta disto é reparado pela ação de uma polimerase (DNA polimerase I) que retira uvrB e a DNA ligase.  (Figura 3).

Este reparo ocorre em humanos e as vias são bem similares às de E.coli.

Reparo direto
Dímeros de ciclobutano pirimidina podem ser reparados diretamente sem a excisão por uma enzima chamada de DNA fotoliase que usa a energia derivada da luz absorvida para regenerar as duas pirimidinas que formaram dimerização induzida por luz UV. A fotoliase contém dois co-fatores que servem como agentes de absorção de luz (cromóforos), um derivado do ácido fólico. (Figura  4)

Um outro exemplo de reparo direto envolve o reparo de O 8metilguanina no DNA formada pela ação de certos agentes alquilantes. O 8metilguanina é uma lesão altamente mutagênica e carcinogênica. A enzima O 8metilguanina DNA metil transferase remove este grupamento metil da guanina transferindo este para um resíduo específico de citosina na transferase, inativando-a.   (Figura 5)

 

Reparo por recombinação
Se durante a replicação cromossomal, uma forca de replicação encontra uma lesão (por exemplo um dímero de timina) antes da ação do reparo por excisão ou da ação do sistema de fotoliase, a DNA polimerase irá parar a replicação no dímero encontrado.Esta região será então reparada por recombinação entre dois dúplexes de DNA na forca de replicação. (Figura  6)

 

 

REPARO DE DNA EM ORGANELAS
Desde a descoberta de que a mitocôndria apresenta um genoma próprio, independente do genoma nuclear, levantou-se a questão se eles estavam sujeitos aos mesmos mecanismos de reparo que ocorrem no genoma nuclear. Entretanto, por muito tempo acreditou-se que o reparo de DNA não estava presente no genoma dessa organela. Nesse sentido, o reparo não seria necessário devido à redundância da informação genética presente nas várias cópias do DNA das organelas. Essa visão era reforçada pelas observações de que: o genoma dessa organela não codifica para nenhum gene envolvido no reparo do DNA (Britt, 1996); o DNAmt apresenta uma maior taxa de mutação quando comparado com o nuclear (Richter et al., 1988); e pelo fato de que algumas lesões, como dímeros de pirimidina, não são removidas eficientemente do DNA mitocondrial (DNAmt) de mamíferos (LeDoux et al., 1992).

 
No entanto, a retirada eficiente de purinas metiladas  (LeDoux et al., 1992); a presença da enzima UV endonuclease na mitocôndria de mamíferos (Tomkinson et al., 1990); além dos estudos de Thyagarajan e colaboradores. (1996), que verificaram que extratos protéicos mitocondriais são capazes de catalisar a recombinação de plasmídeos "in vitro" (sendo que os autores sugerem que esta atividade de recombinação está relacionada com o reparo de DNA mitocondrial); indicam que o genoma de organelas está sujeito a outros tipos de reparo, embora nenhuma evidência sugira que ocorra o reparo por excisão de nucleotídeos nesta organela.
Entretanto, os dados mais interessantes sobre o reparo de DNA mitocondrial advém do estudo com plantas e levedura. Pang e colaboradores (1993) clonaram um gene de A. thaliana capaz de complementar bactérias deficientes no reparo por excisão de nucleotídeos. O gene ainda não tem função definida e não apresenta homologia com nenhum gene conhecido, entretanto, verificou-se que ele é direcionado para cloroplasto e mitocôndria. Outro gene de planta, thi1, também é capaz de complementar bactérias deficientes no reparo por excisão de nucleotídeos (Machado et al., 1996). Esse gene além de participar na síntese de tiamina também esta envolvido na estabilidade do DNA mitocondrial, tanto em planta, como em S. cerevisiae (Machado et al., 1997).
O conhecimento do reparo de DNA mitocondrial pode ser essencial no estudo de diversas doenças que estão associadas com a mitocôndria, bem como com o processo de envelhecimento.

 

DOENÇAS HUMANAS RELACIONADAS AO REPARO DE DNA

Dentre diversas outras doenças humanas relacionadas com deficiências no reparo do DNA, podemos citar a síndrome de Cockayne's (CS). Além de XP (Xeroderma Pigmentosum) , CS e TTD apresentam alguma deficiência no reparo por excisão de nucleotídeos e transcrição do DNA (Friedberg, 1996). Os estudos com células de pacientes XP permitiram a clonagem dos genes humanos envolvidos no reparo por excisão de nucleotídeos.
O mecanismo do reparo por excisão de nucleotídeos no homem é muito semelhante ao descrito para E. coli. Neste organismo, o gene XPA é responsável pelo reconhecimento da lesão e recrutamento dos outros componentes desse sistema de reparo (Sancar, 1996). Os genes XPB e XPD estão envolvidos na estabilização do complexo de pre-incisão, entretanto, o achado mais importante verificado para esses genes é que as proteínas, por eles codificados, fazem parte do fator de transcrição IIH (TFIIH)(Sancar, 1996). Esse fato está de acordo com a descoberta de Bohr e colaboradores (1985) da existência do reparo de DNA preferencial de genes transcritos.
Os genes XPG e XPF são os responsáveis pela incisão do DNA contendo o nucleotídeo lesado (Sancar, 1996). Diferentemente do verificado em E. coli, no homem, o fragmento excisado é de 23 nucleotídeos e não de 12. Mutações nos genes CSA e CSB são responsáveis pela CS (Sancar, 1996). Esses genes parecem estar envolvidos com o reparo preferencial de genes transcritos, pois existem evidências de que o heterodímero formado pelas proteínas CSA e CSB reconheceriam a RNA polimerase II, bloqueada em uma região de DNA lesado e seriam, então, responsáveis pelo recrutamento do complexo de reparo por excisão de nucleotídeos (Sancar, 1996).
A TTD, além de apresentar um fenótipo relacionado à deficiência no reparo de DNA, também apresenta como característica uma menor ocorrência de proteínas ricas em cisteína (Friedberg, 1996). Até o momento, foram identificados três grupos de complementação relacionados com essa doença. Os genes XPB e XPD complementam dois destes grupos, portanto, mutações nesses genes podem levar a duas doenças relacionadas, mas com sintomas diferentes (Friedberg, 1996). O gene relacionado ao terceiro grupo de complementação foi denominado TTD-A e sua função ainda é desconhecida.
No homem, o reparo por excisão de base é extremamente similar ao verificado em bactérias, tanto que a maioria dos genes humanos, envolvidos nesse mecanismo de reparo, apresentam alta homologia com os genes de E. coli e são capazes de complementar as bactérias deficientes nesses genes (Friedberg, 1995). Até o momento, nenhuma doença humana foi relacionada a esse tipo de reparo, nem mesmo algum tipo de câncer (doença frequentemente associada a deficiência no reparo de DNA) (Lindahl et al., 1997).
A inviabilidade de camundongos transgênicos nocauteados em genes envolvidos no reparo por excisão de base, além de mostrar a importância desses genes no desenvolvimento embrionário, também pode explicar a ausência de doenças associadas a este tipo de reparo (Lindahl et al., 1997).
Apesar de vários genes humanos envolvidos no reparo de DNA já serem conhecidos, novos genes que participam desse processo têm sido descritos. Entretanto, até o momento nenhum gene humano que atua no reparo do genoma mitocondrial foi clonado.