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Técnicas em Biologia Molecular

 

Técnicas de uso corrente na avaliação da diversidade genética

 

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Considerações Gerais - Para certos tipos de análise, a reação de PCR específica apresenta um grande fator limitante: o seu uso em larga escala (ex., vários locos) requer o conhecimento dos nucleotídeos que compõem as duas extremidades da sequência de DNA que se deseja amplificar. Com base neste conhecimento é que o par de primers que flanqueiam uma região-alvo no DNA pode ser sintetizado e utilizado na amplificação desta sequência através da reação da polimerase em cadeia. No início da década de 90 dois grupos apresentaram uma variação da técnica de PCR que foi denominada de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA, Williams et al., 1990) ou AP-PCR (Amplified Polymorphism - Polymerase Chain Reaction, Welsh & McClelland, 1990). Esta variação foi desenhada para contornar o problema do conhecimento prévio da sequência de DNA que se deseja amplificar, possibilitando a utilização da técnica em organismos onde nenhum conhecimento de sequência de DNA existia (praticamente a maioria esmagadora dos organismos). A modificação baseia-se na utilização de apenas um primer (decâmero) na reação de PCR, alterando também as condições específicas de amplificação da reação, além do desenho do próprio primer. Esta variação possibilita que ocorra amplificação ao acaso de segmentos de DNA no genoma. A amplificação é função da probabilidade de, após a desnaturação da fita dupla de DNA, existir no genoma uma sequência complementar ao primer em uma das fitas e, a uma distância que possa ser percorrida pela polimerase, uma outra sequência complementar ao primer na fita oposta. Portanto, a reação de RAPD ocorre devido ao anelamento do primer único em pontos próximos do genoma, delimitando a região que será amplificada(Williams et al., 1990; Welsh & McClelland, 1990).

É intuitiva a noção de que o número de bandas observadas é função da própria complexidade do genoma analisado. O polimorfismo detectado em um loco RAPD refere-se, em última análise, a mutações que ocorrem na fita de DNA impedindo o anelamento do primer a intervalos de fita que permitam a amplificação do segmento pela polimerase. Como resultado, nos locos onde a reação de PCR ocorre em progressão geométrica o segmento de DNA é amplificado e observado em gel de eletroforese. A reação de PCR pode não ocorrer, por outro lado, devido ao não anelamento do primer com o DNA. O resultado é a ausência de bandas em gel de eletroforese para um indivíduo homozigoto naquele loco. Outras causas de polimorfismo em loco RAPD são, por exemplo, inserções ou deleções de sequências. Marcadores RAPD são tipicamente dominantes, isto é, o fenótipo eletroforético de um indivíduo heterozigoto para um determinado loco não é geralmente distinguido de um indivíduo homozigoto para o alelo amplificado. Estas qualidade, naturalmente, pode limitar a utilização de RAPDs para certos tipos de análise.

Conteúdo Informativo e Acessibilidade - A análise conjunta da capacidade multiplex, capacidade de identificação de alelos e proporção de locos polimórficos por reação permite comparar as diferentes técnicas moleculares em relação à sua eficiência para análise de variabilidade genética (Figura 1). Marcadores RAPD em geral apresentam um bom conteúdo informativo, isto é, possuem uma boa capacidade multiplex (amostram o genoma em vários locos ao mesmo tempo), identificam um bom número de locos polimórficos por reação, embora discriminem um baixo número de alelos por loco (dois alelos, amplificado e não-amplificado) (Figura 1). Alia-se a isto o fato de ser uma técnica altamente acessível, por ser rápida, de baixo custo e pouco intensiva em mão-de- obra (Figura 2). Esta alta acessibilidade confere à técnica uma boa aceitação para análises relacionadas à: (a) diferenciação de linhagens, (b) estimativa de variabilidade em Bancos de Germoplasma, (b) estudo de estrutura genética de populações, (d) estimativa de parâmetros genéticos, (e) estudos de duplicação de acessos em Bancos de Germoplasma, (f) análise de paternidade, etc. É importante salientar que a técnica de RAPD democratizou sobremaneira a utilização de marcadores moleculares em análise genética, particularmente no âmbito da análise de variação genética. Apeser de ter sido desenvolvida recentemente, já são inúmeros os trabalhos que analisam e estimam diversidade genética de diferentes espécies animais e vegetais utilizando a técnica.

Figura 1. Comparação de técnicas de marcadores moleculares quanto ao conteúdo informativo. Foram considerados três componentes que influenciam o conteúdo informativo médio de cada técnica: o número de locos amostrados por ensaio (capacidade multiplex), o número de alelos identificados por loco e a proporção de locos polimórficos observada em cada ensaio (SAT = minisatélite).

 

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Considerações Gerais - O polimorfismo de comprimento de fragmentos de DNA (RFLP), obtido através do tratamento do DNA com enzima de restrição, é observado através de uma sequência de passos que tornam a técnica robusta, mas ao mesmo tempo trabalhosa. A análise de RFLP em genoma cloroplástico é mais simples visto ser este genoma bem menor que o nuclear. Neste caso, o ensaio RFLP consiste na obtenção de cpDNA e tratamento do mesmo com enzima de restrição, seguido de eletroforese para separação dos fragmentos de acordo com o seu comprimento (tamanho). Por ser circular, o número de fragmentos obtidos do cpDNA corresponde ao número de sítios de restrição reconhecidos pela enzima neste genoma. O genoma nuclear, por outro lado, é muitas vezes maior e mais complexo que o genoma cloroplástico. Assim sendo, o simples corte com enzima de restrição seguido de eletroforese não permite a identificação de fragmentos únicos, mas a observação de um arrasto no gel, devido à presença de milhares de fragmentos de diferentes tamanhos na matriz de eletroforese. Desta forma, duas outras etapas são necessárias para se observar polimorfismo: a obtenção e seleção de clones de DNA e a hibridização destes clones com fragmentos homólogos do genoma, fragmentado e fixado em membranas de nylon. Sucintamente, em se tratando de espécies onde pouca ou nenhuma informação genética é disponível, a obtenção de clones de DNA é feita através da construção de bibliotecas (gen&ocircmicas ou de cDNA) e seleção de clones informativos para o estudo que se planeja desenvolver. Com exceção de algumas poucas espécies onde extensos mapas genéticos e um grande número de clones são disponíveis (ex. milho, arroz, soja, etc.), regra geral faz-se necessário a construção de bibliotecas de clones e laboriosa seleção de clones informativos antes de se iniciar um estudo com RFLP. Isto é particularmente característico de espécies tropicais agrícolas e florestais, onde o conhecimento genético é incipiente. A seleção de clones informativos em geral baseia-se na escolha de clones de cópia única, isto é, de clones de sequência homóloga a segmentos de um único loco no genoma. Isto facilita sobremaneira os estudos de segregação Mendeliana para a construção de mapas genéticos, em espécies diplóides e em poliplóides. Selecionados os clones informativos, o próximo passo da técnica envolve a marcação do clone (radioativa ou luminescente) e hibridização com o DNA clivado e desnaturado, fixado após a eletroforese em uma membrana (Southern, 1975). A exposição da membrana a filme de raio-X após a hibridização com sondas marcadas leva à sensibilização do filme no ponto em que a sonda hibridiza com fragmento homólogo, formando uma banda na autoradiografia. Marcadores RFLP são em geral co- dominantes, isto é, permitem a identificação de alelos maternais e paternais em indivíduos heterozigotos.

Conteúdo Informativo e Acessibilidade - Marcadores RFLP de cópia única possuem, por definição uma baixa capacidade multiplex (Figura 1). É possível hibridizar duas ou mais sondas em regiões distintas de uma membrana, incrementando o número de locos amostrados em cada ensaio, mas isto não é normalmente feito em larga escala. O número médio de alelos RFLP identificados por loco varia de acordo com a estrutura gen&ocircmica da espécie estudada, mas não é tão alto como SSR. A proporção de locos polimórficos em um ensaio RFLP também não é alta. Em espécies autógamas, por exemplo, um bom número de locos RFLP devem ser analisados até que polimorfismo seja encontrado. A técnica RFLP, por se basear em homologia de sequência, é uma técnica bastante robusta, adequada a estudos a nível intraespecífico, interespecífico e mesmo intergenérico. Contudo, trata-se de uma técnica trabalhosa, de custo elevado e morosa para a obtenção de dados, ou seja, de baixa acessibilidade (Figura 2).

 

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Considerações Gerais - AFLP é uma combinação de RFLP e RAPD, incorporando ainda alguns elegantes passos experimentais. A técnica envolve a digestão de DNA com enzima de restrição, conforme requer uma análise de RFLP (veja abaixo). Neste caso, porém, o DNA é digerido com dois tipos de endonucleases (corte raro e corte frequente), gerando fragmentos de diferentes tamanhos. O passos seguintes assemelham-se aos princípios da técnica RAPD: adicionam-se adaptadores que complementam as sequências do sítio de restrição e primers complementares aos adaptadores. A reação de polimerase em cadeia nestas condições amplifica segmentos de DNA ao acaso no genoma (Zabeau and Vos, 1993). A capacidade multiplex da técnica AFLP pode ser controlada primeiramente com a utilização de endonucleases específicas. Pode também ser controlada através do uso de nucleotídeos extras na extremidade 3' dos adaptadores. Pode ser controlada, por fim, com a marcação (radioativa ou luminescente) do primer homólogo ao adaptador do sítio de corte raro nos fragmentos. Os fragmentos analisados são tipicamente dominantes, embora haja potencial para desenvolvimento de algorítimos que analisem imagem digitalizada, distinguindo indivíduos homozigotos e heterozigotos.

Conteúdo Informativo e Acessibilidade - Um dos grandes atributos da técnica de AFLP é sua capacidade multiplex e o próprio controle desta capacidade. Um grande número de locos pode ser amostrado em um único gel AFLP. O número médio de locos polimórficos também é alto nestas amostras. Por outro lado, a capacidade de identificação de alelos nos locos é restrita (Figura 1). A rapidez de obtenção de dados alia-se ao baixo custo e simplicidade técnica, tornando a acessibilidade da técnica AFLP bastante alta (Figura 2). Poucos são os exemplos de utilização de AFLP na análise da diversidade genética ou em programas de melhoramento. Uma limitação para países em desenvolvimento é a etapa de marcação radioativa. Como é sabido, a disponibilidade de isótopos radioativos com 32P é limitada em vários países. Por outro lado, alguns laboratórios começam a empregar marcação não-radioativa na análise de AFLP em sistemas automatizados ou não (Steve Kresovich, comunicação pessoal). Vários laboratórios começam agora a se interessar pelo emprego em larga escala da técnica e observa-se uma tendência acentuada de se utilizar a técnica na análise de Bancos de Germoplasma, testes de identidade/paternidade e estudos populacionais.

 

SAMPL (Selective Amplification of Microsatellite Polimorphic Loci)

Considerações Gerais - Trata-se de uma versão multiplex do ensaio SSR, combinada a alguns passos da técnica de AFLP. A amplificação seletiva de locos polimórficos microsatélite (SAMPL) combina a capacidade multiplex de AFLP com a capacidade de discriminação alélica de SSR, em uma única reação (Vogel et al, 1994). Esta técnica ainda está em pleno desenvolvimento e atravessa testes preliminares em diferentes organismos, mas os dados acumulados até agora sugerem um grande potencial para a análise de diversidade genética. A técnica baseia-se na substituição de um dos primers usados na técnica AFLP (homólogo ao adaptador) por primer homólogo a uma sequência repetitiva. Desta forma, a amplificação via PCR se dará entre a sequência repetitiva e o primer homólogo ao adaptador, detectando polimorfismo existente dentro da sequência repetiva. No momento, SAMPL tem sido prioritariamente utilizado para amostrar polimorfismo em locos de sequências repetivas compostas (ex. (CA)10(AT)8). A razão básica para isto é técnica: em geral observa-se que se não for feito um "ancoramento" do primer dentro da sequência repetiva, perde-se resolução nas bandas (Julie Vogel, comunicação pessoal). O ancoramento, que contorna este problema, baseia-se na utilização de um primer que seja ao mesmo tempo homólogo às duas sequências repetitivas que compõem um loco microsatélite composto (ex. primer (CA)2(AT)3 para a sequência descrita acima). A maior parte dos locos SAMPL amostrados são co-dominantes.

Conteúdo Informativo e Acessibilidade - SAMPL une o potencial de detecção de polimorfismo, característico de marcador SSR, com a capacidade multiplex da técnica AFLP. É, portanto, uma técnica de alto conteúdo informativo (Figura 1). O número de locos acessados (capacidade multiplex) é alto e o polimorfismo detectado em cada reação é superior ao observado com AFLP. O número de alelos detectados por locos é alto, variando em relação a SSR somente no que tange às peculiaridades de sequências compostas em relação a sequências únicas. Tanto o custo de implementação da técnica como a demanda em trabalho assemelham-se à técnica SSR (Figura 2), ou seja, não se trata de uma técnica imediatamente acessível. Uma vez obtidos os primers informativos, no entanto, o ensaio SAMPL torna-se rápido, e os custos caem significativamente, incrementando substancialmente a acessibilidade da técnica. Os resultados obtidos com SAMPL até o momento limitam-se a poucas espécies, mas apontam para grande eficência e utilidade em estudos genéticos.

Técnicas baseadas em restrição e hibridização de sequências de DNA

O desenvolvimento de técnicas baseadas na hibridização de sequências de DNA abriu novas opções para o estudo de variações na fita de ácido deoxiribonucléico já no final da década de 70 e início dos anos 80. A descoberta de enzimas de restrição, a possibilidade de transferência de fragmentos de DNA para membranas permitindo a reutilização dos fragmentos de DNA de um gel de eletroforese em outros ensaios (Southern, 1975), e o desenvolvimento de novos métodos de marcação radioativa e luminescente para fins de hibridização de fragmentos de DNA determinaram o emprego eficiente de RFLP em análise genética. A posterior identificação de sequências repetitivas de DNA de comprimento longo (minisatélites) e a utilização destas sequências como sondas em análise gen&ocircmica possibilitou o desenvolvimento de uma nova classe de marcadores adequados à análise de fingerprinting de DNA.

 

Minisatélites

Considerações Gerais - Marcadores minisatélites constituem, na essência, uma variação da técnica RFLP: na etapa de hibridização seleciona-se clones de múltipla cópia que possibilitam a amostragem de vários locos do genoma em um único ensaio. Minisatélites são sequências de DNA cuja unidade repetitiva é observada lado a lado inúmeras vezes em um loco, e que se repetem também em vários outros locos no genoma. Isto significa que ao isolar o núcleo de uma sequência repetitiva minisatélite, ele pode ser utilizada como sonda para gerar em uma única reação uma impressão digital do DNA de um organismo. Por amostrar inúmeros locos ao mesmo tempo, este perfil eletroforético observado é muitas vezes suficiente para identificar e diferenciar um indivíduo do outro, com base nas variações observadas no DNA. Esta técnica tem, por exemplo, grandes aplicações na análise forênsica em seres humanos e, da mesma forma, no estudo de diversidade genética da fauna e flora. É possível se identificar alelos de um loco minisatélite em uma autoradiografia em estudos de população segregante, mas o grande número de locos amostrados dificulta tremendamente este esforço. Trata- se, portanto, de marcadores tipicamente co-dominantes, mas em geral analisados como marcadores dominantes em estudos de diversidade genética em populações naturais.

Conteúdo Informativo - Minisatélites se apresentam, de maneira geral, como uma técnica de alto conteúdo informativo (Figura 1). A capacidade multiplex da técnica é um dos seus maiores atributos. Dezenas de locos são amostrados em uma única reação, uma boa parte deles apresentando polimorfismo entre indivíduos de uma população. O número médio de alelos por loco é baixo pela incapacidade imediata de identificação dos mesmos devido à complexidade dos padrões de bandas analisados. Quanto à acessibilidade da técnica, as considerações são semelhantes às levantadas para RFLP de cópia única, isto é, baixa acessibilidade devido ao trabalho envolvido. Há um descréscimo, contudo, no custo e na rapidez dos ensaios por dado obtido, visto que um maior número de locos é amostrado em cada ensaio.

 

Southern Blotting

Legenda: Detecção de fragmentos específicos de DNA por Southern blotting.
(A) A mistura de fragmentos de DNA de dupla fita gerados pelo seu tratamento com nucleases é separado de acordo com o peso molecular na eletroforese.
(B) Uma folha de papel de nitrocelulose ou papel de nylon é colocado sobre o gel, e os fragmentos de DNA separados são transferidos para a folha pelo blotting. O gel e mantido em um suporte de esponja em um banho de solução alcalina, e o tampão é sugado através do gel e do papel de nitrocelulose pelo papel toalha empilhado em cima da nitrocelulose. De acordo que o tampão é absorvido, os fragmentos de fita simples é transferido do gel para a superfície da folha de nitrocelulose, onde se adere firmemente. Esta transferência e necessária para manter o DNA firme ao local no qual a hibridição acontece.
(C) A folha de nitrocelulose é cuidadosamente retirada do gel. (D) A folha contendo a banda correspondente ao DNA de fita simples está dentro de um saco plastico selado contendo tampão e a sonda, de DNA marcado radioativamente, específica para a sequência de Dna desejada. A folha é exposta por um longo período de tempo à sonda sobre condições favoraveis de hibridização. (E) A folha removida do saco e lavada rigorosamente, somente o DNA hibridizado com a sonda ficara retido no papel. Depois é autoradiografado, o DNA que está hibridizado com a sonda aparecerá como bandas na autoradiografia. Uma adaptação desta técnica para detectar sequências específicas em RNA é chamado de Northern blotting. Neste caso moleculas de mRNA são analisadas em gel de eletroforese e a sonda é usualmente uma fita simples de DNA.