Conteúdo - Tópicos Comentados - Diagnóstico - Técnicas citogenéticas


PADRÕES DE BANDEAMENTO:

Cromossomos em metáfase podem ser identificados usando certa técnicas de coloração, chamadas de bandeamento. Células são cultivadas e então são paradas em metáfase (colchicina), o número máximo de células adequadas para o processo. Então elas são espalhadas em uma lâmina, marcadas com o corante adequado e visualizadas em microscópio. A maioria dos testes convencionais de citogenética dependem da cariotipagem de bandeamento de cromossomos em metáfase.

Uma banda é definida como aquela parte do cromossomo na qual é claramente distinguida da do segmento adjacente apresentando-se mais escuro ou claro. Os cromossomos são visualizados como uma série continua de bandas claras e escuras.

As técnicas de bandeamento acabam caindo em dois grupos: 1) Aqueles que resultam em bandas distribuídas ao longo de todo o comprimento do cromossomo, tais como bandas G-, Q- e R- e 2) aquelas que colorem um número restrito de bandas específicas ou estruturas. Essas depois incluíram métodos que revela bandas centromericas, bandas C, e regiões organizadoras de nucléolo, NOR’s (na regiões terminais dos cromossomos acrocêntricos). Métodos de bandeamento C não permitem a identificação de muitos cromossomos em células somáticas, mas podem ser usados para identificar cromossomos específicos.

 

Figura 01, Figura 02 e Figura 03

 

Bandas G e R podem ser de campo claro ou fluorescente

 

Bandeamento G de campo claro:

Bandas G são as mais comumente usadas. Eles usaram esse nome da tinta Giemsa, mas pode ser produzido com outras tintas. Nas bandas G, as regiões negras tendem a serem heterocromatinas (contem muitas repetições e genes não funcionais; função estrutural), são de replicação lenta e são ricas em AT. As regiões claras tendem a serem eucromatinas (regiões ativas em transcrição), de replicação adiantada e ricas em GC.

 

Bandas R de campo claro

Essas bandas R são aproximadamente o reverso das bandas G (o R vem de reverso). As regiões escuras são eucromatinas e as regiões claras são heterocromatina.

 

Bandas G e R fluorescentes

Essas bandas são fotografias negativas das versões de campo claro. i.e. o reverso de bandas G e bandas R de campo claro.

Bandas Q são parecidas com bandas G, mas certas regiões heterocromáticas são coradas de maneira mais brilhantes com o bandeamento Q.

 

Aplicações:

O Cariótipo com Banda G em Alta Resolução é indicado quando se suspeita de microdeleções cromossômicas associadas a síndromes genéticas, como por exemplo Síndrome de Angelman e Síndrome de Prader-Willi. São utilizadas drogas especiais que descondensam mais os cromossomos, possibilitando a evidenciação de bandas em uma resolução muito superior à normalmente utilizada na rotina.

a) malformação congênita - aborto de repetição;

b) atraso no desenvolvimento - natimorto;

c) amenorréia primária - suspeita de síndrome cromossômica.

O cariótipo de sangue com banda G pode diagnosticar as seguintes síndromes

- Síndrome de Down (trissomia do cromossomo 21);

- Síndrome de Patau (trissomia do cromossomo 13);

- Síndrome de Edwards (trissomia do cromossomo 18);

- Síndrome de Turner (monossomia do cromossomo X);

- Síndrome de Klinefelter (47,XXY);

- Síndrome Cri-du-chat (deleção 5p);

- Síndrome de Klinefelter (47, XXY);
- Síndrome 47, XYY;
- Trissomia do X (47, XXX);
- Síndrome deTurner (45, X e variantes);

- Outras alterações cromossômicas raras.

Obs.: O Estudo da Síndrome de Turner pode ser associado à Pesquisa do Cromossomo Y

 

 

HIBRIDIZAÇÃO FLUORESCENTE IN-SITU (FISH)

Hibridização fluorescente in-situ é um método usado para identificar partes especificas de um cromossomo. Por exemplo, se você conhece uma seqüência de certo gene, mas não sabe em qual cromossomo o gene está localizado, você pode usar FISH para identificar o cromossomo em questão e a exata localização do gene. Ou, se você suspeita que ocorreu um translocação em um cromossomo, você pode usar a prova que abarca todo o local de quebra/translocação. Se não houve translocação naquele ponto, você vai ver um sinal, desde que prove hibridização em algum lugar do cromossomo. Se, de qualquer maneira, ter ocorrido translocação, você vai ver dois sinais, desde que se prove ser possível a hibridização de ambas as terminações do ponto de translocação.

Para usar FISH eficientemente, você deve saber o que você está procurando, i.e. você usualmente suspeita de um defeito particular, baseado na aparência de certo cromossomo, etc.

Como isso funciona:

- Faça a prova complementar para conhecer a seqüência. Quando estiver fazendo a prova, marque-a com um marcador fluorescente, e.g. fluorescina, pela incorporação de nucleotídeos que tem o marcador anexado a ele.

- Ponha o cromossomo na lâmina de microscópio e desnature-o (separa as fitas da dupla hélice).

- Desnature a prova e adicione-a na lâmina de microscópio, deixando a prova hibridizar com seu lado complementar.

- Lave o excesso de prova e olhe o cromossomo em microscópio fluorescente. A prova irá aparecer com um ou mais sinais fluorescente no microscópio, dependendo de quando lugares foram capazes de hibridizar.

 

Exemplos de hibridização fluorescente in-situ:

FISH00.jpg essa imagem mostra cromossomos com banda R fluorescentes. A imagem foi pseudocolorida para ficar parecida com a do microscópio. De qualquer forma o sistema de imagens torna os cromossomos em preto e branco. Os pontos brilhantes são provas complementares para receptores olfatórios homólogos, mas no cromossomo 2 (no fundo a esquerda) nos vemos que a prova hibridizou com o meio do cromossomo. Uma comparação com cromossomos de macacos mostra que o cromossomo humano 2 é resultado de uma fusão de um terminal com outro de dois cromossomos ancestrais. Como resultado as duas terminações subtelomericas tornaram-se o meio do cromossomo 2, o qual é o porque de nos pegarmos prova de hibridização lá. (Imagem por Cynthia Friedman and Barbara Trask)

FISH01.jpg

FISH002.jpg Essa imagem mostra a prova para o gene Xist, no cromossomo X

FISH003.jpg Essa imagem mostra um paint (uma variação do FISH que cora lugares ou cromossomos específicos) do cromossomo 22. Em acrescimo as duas copias normais do 22, há um pequeno pedaço extra, um marcador, derivado do material do 22.

Aplicações:

Síndrome de Williams -> del(7)(q11.23)

Síndrome de Prader-Willi -> del(15)(q12)

Síndrome de Angelman -> del(15)(q12)

Síndrome Miller-Dieker (Isolated lissencephaly) -> del(17)(p13.3)

Doença de Charcot-Marie-Tooth (Tipo 1A) -> dup(17)(p12)

Neuropatia Hereditária -> del(17)(p12)

Síndrome de Smith-Magenis -> del(17)(p11.2)

Síndrome de DiGeorge/Síndrome Velocardiofacial -> del(22)(q11.2)

Adrenal hipoplasia congênita (Glycerol kinase deficiency) -> del(X)(p21)

Síndrome de Kallman (Steroid sulfatase deficiency) -> del(X)(p22.3)

 

 

CARIOTIPAGEM ESPECTRAL (SKY)

O novo método de cariotipagem usa corantes fluorescentes que se ligam a regiões específicas do cromossomo. Usando de uma série de provas específicas que variam com a quantidade de corante, diferentes pares de cromossomos têm características espectrais únicas. Uma vantagem única da tecnologia é o uso de um interferômetro similar aos que são usados pelos astrônomos para medir o espectro de luz emitido pelas estrelas. Minúsculas variações na cor, não perceptível ao olho humano, são detectadas por um programa de computador que então a re-colore numa cor fácil de distinguir para o olho humano, isso com cada par de cromossomo. O resultado é uma imagem digital melhor que o filme, em cores fortes. O pareamento de cromossomos é fácil porque os pares homólogos são da mesma cor, e aberrações e cross-overs são mais facilmente reconhecidos. E ainda, o cariótipo espectral tem sido usado para detectar translocações não perceptíveis pelo método tradicional de bandeamento.

Uma resumo do método de cariotipagem espectral.

SKY00.GIF

SKY01.GIF

SKY02.GIF

Na imagem, três corantes diferentes foram adicionados aos cromossomos. Um interferômetro filtrou a luz emitida, mandando um sinal para a câmera que criou uma imagem digital. Para corantes fluorescentes que sobrepõe espectro, como é nesse caso, a apresentação das cores pode ser totalmente similar (na imagem todos os 6 cromossomos parecem “verdes”). Embora para o olho humano isso pareça tudo a mesma cor, sutis diferenças em seus comprimentos de onda podem ser detectadas pelo interferômetro. O comprimento necessário de valores espectrais para exibir cores de um cromossomo difere pelo menos 15 nanômetros, cromossomos podem ser distinguidos um dos outros baseado no espectro deles. Com as características espectrais de cada par de cromossomo caracterizada, o computador sinaliza uma nova cor a diferentes cromossomos. Pelo recolorimento, o problema de sobreposição de emissão de espectros que aparece na primeira imagem é resolvido. Essas novas cores são referidas como cores de classificação porque elas permitem uma classificação dos cromossomos em um cariótipo.

SKY03.GIF Diferentes cores para um cariótipo humano

SKY04.gif Cores de classificação permitem uma melhor discriminação.

SKY05.gif O cariótipo espectral humano

SKY06.gif Cromossomos vindos do pai de uma criança retarda. A figura convencional de um cromossomo não mostra nenhuma mudança, mas a classificação espectral dos cromossomos mostra que uma porção do cromossomo 11 (azul) foi transferida para o cromossomo 1 (amarelo)

SKY07.gif Cromossomo de um paciente com ataxia mostrando a transferência de material do cromossomo 4 para o 12.

SKY08.gif A análise dos cromossomos de uma célula de câncer de seio humano mostra múltiplas alterações. Analise das mudanças pode permitir predições da severidade da doença e também pode ajudar a direcionar a terapia contra o câncer.

Aplicações:

- A técnica permite a identificação de cromossomos anormais e pode ser usada para estudos humanos, incluindo doenças genéticas, câncer e quebras de DNA. Essas técnicas também podem ser automatizadas para uma rápida classificação das populações humanas. Desde recentemente em torno de 400.000 diagnósticos por cariótipo são feitos por ano, há um amplo potencial de aplicações. Também, ele pode ser usado para pesquisas evolucionárias, detectando minúsculas diferenças em várias espécies ao longo do tempo.

- Leucemia: O marcador (cromossomo Philadelphia) é formado de uma translocação entre os cromossomos 9 e 22. É observado em pacientes com LMC, que corresponde a cerca de 20 a 25% das leucemias. Ele é um marcador citogenético de importância clínica e é encontrado em mais de 95% dos pacientes com LMC. O cariótipo de medula óssea está indicado principalmente nos casos de LMC e demais leucemias. Também é importante em outras desordens hematológicas malignas.